IPTG có thực sự làm mất khả năng cảm ứng vĩnh viễn?

Có, và tôi sẽ điều chỉnh lại phát biểu trước đây: Tài liệu khoa học ủng hộ mạnh mẽ quan điểm rằng sự biểu hiện cao sau cảm ứng gây ra gánh nặng tăng trưởng/trao đổi chất, có thể dẫn đến sự bất ổn của plasmid hoặc làm giàu quần thể có biểu hiện thấp; nhưng không có bằng chứng nào cho thấy 'chỉ cần đã từng tiếp xúc với IPTG, tất cả thế hệ sau sẽ vĩnh viễn mất khả năng cảm ứng trở lại'. Sự mất khả năng cảm ứng thực tế đòi hỏi phải có sự mất plasmid hoặc thay đổi di truyền/điều hòa ^NPP.

• Cảm ứng và biểu hiện protein tái tổ hợp cao làm giảm tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống.
  Một nghiên cứu trên hệ thống cảm ứng IPTG cho thấy sự cảm ứng ảnh hưởng tiêu cực đến sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của tế bào trôi nổi, và việc duy trì plasmid sao chép cao tự nó đã tạo ra một gánh nặng trao đổi chất (metabolic burden) hạn chế khả năng biểu hiện protein ngoại lai ở mức cao. ^P
  Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng gánh nặng phiên mã và dịch mã của gen ngoại lai làm giảm hiệu suất biểu hiện; ở nhiệt độ cao và nồng độ IPTG cao, sự tăng trưởng và hô hấp bị ảnh hưởng rõ rệt hơn. ^PP

• Sự bất ổn/mất plasmid là hiện tượng có thật sau cảm ứng, nhưng phụ thuộc vào chủng, vector và điều kiện nuôi cấy.
  Trong một so sánh các hệ thống biểu hiện E. coli công nghiệp, chủng HMS174(DE3) ngừng tăng trưởng sau cảm ứng nhưng vẫn giữ được vector biểu hiện; trong khi BL21(DE3) và RV308(DE3) bị mất plasmid (plasmid loss) và tiếp tục tăng trưởng. ^N
  Do đó, nếu protein mục tiêu làm cho tế bào có plasmid đúng phát triển chậm hơn, các tế bào biểu hiện ít hơn, mất plasmid hoặc có đột biến có lợi có thể tích lũy tương đối trong quần thể; đây là cơ chế hợp lý giải thích việc 'cảm ứng sau kém hiệu quả', chứ không phải là hiệu ứng tất yếu và có thể di truyền của IPTG. ^NPP

• Tính độc của protein tái tổ hợp là yếu tố nguy cơ quan trọng.
  Độc tính của protein tái tổ hợp trong E. coli là một vấn đề đã biết, thậm chí đã thúc đẩy việc sử dụng các chủng đột biến có nguồn gốc từ BL21 như C41(DE3) và C43(DE3), vốn phù hợp hơn để biểu hiện các protein độc hại. ^P
  Trong một mô hình kỹ thuật trao đổi chất cụ thể trên BL21(DE3), IPTG kết hợp với cơ chất độc hại gây ra áp lực sinh lý đáng kể; điều này không thể khái quát thành 'IPTG chắc chắn độc hại', nhưng nó cho thấy các điều kiện cảm ứng có thể làm trầm trọng thêm trạng thái vốn đã bị quá tải của tế bào. ^P

• Kết luận chính xác nhất cho câu hỏi ban đầu là:
  Nếu các tế bào mẹ (parent cells) sau một đêm cảm ứng vẫn giữ được plasmid biểu hiện nguyên vẹn và các yếu tố điều hòa, và nếu quần thể mới có đủ thế hệ để phục hồi tăng trưởng khỏe mạnh, thì về mặt lý thuyết, thế hệ con cháu vẫn có thể được cảm ứng lại bằng IPTG ở giai đoạn sau của quá trình nuôi cấy chính.
  Tuy nhiên, cách làm này làm tăng xác suất thất bại biểu hiện, giảm năng suất và tăng biến thiên giữa các mẻ nuôi, đặc biệt trong các trường hợp sử dụng plasmid sao chép cao, promoter mạnh, protein độc hại, cảm ứng kéo dài ở 37°C hoặc nồng độ IPTG cao. ^NPPP

Tài liệu tham khảo được đề xuất

1. Mairhofer J, et al. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during recombinant protein production. Microbial Cell Factories. 2013. — So sánh sự tăng trưởng và mất plasmid của nhiều chủng sau cảm ứng. ^N

2. Tripathi NK, et al. Impact of the Expression System on Recombinant Protein Production in Escherichia coli. 2021. — Thảo luận về gánh nặng trao đổi chất của phiên mã/dịch mã gen ngoại lai và sự lựa chọn hệ thống biểu hiện. ^P

3. Kopp J, et al. Optimizing recombinant protein expression via automated induction profiling in Escherichia coli. 2017. — Cho thấy tầm quan trọng của nồng độ IPTG, nhiệt độ và gánh nặng trao đổi chất đối với sự tăng trưởng và biểu hiện. ^P

4. van Loosdrecht MCM, et al. The Impact of IPTG Induction on Plasmid Stability and Heterologous Protein Production. 2020. — Xem xét trực tiếp mối quan hệ giữa cảm ứng IPTG, tỷ lệ sống/tăng trưởng của tế bào và tính ổn định của plasmid. ^P

5. Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 1999; và các bài tổng quan sau đó. — Giải thích về nguy cơ mất plasmid gia tăng khi sử dụng plasmid sao chép cao, gen ngoại lai độc hại/làm giảm tốc độ tăng trưởng và nuôi cấy mật độ cao. ^S

6. Mairhofer J, et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3). Microbial Cell Factories. 2015. — Ví dụ thí nghiệm về IPTG làm trầm trọng thêm áp lực tế bào vốn có trong một hệ thống cụ thể. ^P

7. Saida F. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 2004. — Tổng quan về độc tính của protein tái tổ hợp và các chủng vật chủ phù hợp. ^P

Về mặt thực nghiệm, để xác định xem một mẻ cụ thể của bạn có thực sự 'mất khả năng cảm ứng' hay không, cách thuyết phục nhất không phải là suy luận lý thuyết, mà là lấy các khuẩn lạc đơn từ mẻ nuôi cấy mới: kiểm tra khả năng kháng kháng sinh, thực hiện cắt giới hạn (restriction digest)/giải trình tự (sequencing) plasmid, và so sánh với đối chứng hạt giống chưa cảm ứng ở cùng OD và cùng điều kiện IPTG bằng SDS-PAGE hoặc Western blot.