AGENTEX тестує нові генетичні коди у пробірці, не змінюючи живий організм

AGENTEX — скорочено від Automated Genetic tRNA Expansion — змінює сам порядок роботи з генетичним кодом. Замість того щоб спершу переписувати геном організму, а вже потім з’ясовувати, чи працює нова система трансляції, дослідники можуть зібрати її in vitro, автоматично перевірити роботизованими методами й використати найкращі варіанти як основу для подальших клітинних експериментів. 6

Заявлені результати вказують на системи, здатні працювати з до 34 амінокислотними будівельними блоками замість 20, які використовує стандартний біологічний код. 7 Ключове досягнення полягає не в збільшенні кількості кодонів понад 64, а в тому, що більшу частину цього обмеженого «словника» можна задіяти в альтернативних призначеннях.

Яке обмеження обходить AGENTEX

Стандартний генетичний код пов’язує 64 можливі триплети-кодони з амінокислотами, а також із сигналами старту й зупинки синтезу білка. Частина кодонів є надлишковою: різні триплети можуть позначати ту саму амінокислоту. Саме ця надлишковість створює можливості для перепризначення.

У живій клітині зміна значення кодону небезпечна. Той самий кодон може траплятися в безлічі життєво важливих генів, тому його нове трактування здатне спричинити масштабне неправильне включення амінокислот у білки. Через це клітинний підхід може вимагати заміни або видалення всіх відповідних кодонів у геномі, а також блокування конкуренції з боку природного апарату трансляції.

AGENTEX переносить перший етап експерименту за межі клітини. Дослідники задають власний набір компонентів трансляції й перевіряють, чи дає запропонована відповідність «кодон — амінокислота» потрібний білок або пептид, перш ніж братися за масштабну модифікацію геному. 615

Як працюють перепроєктовані коди

Кодон зчитується завдяки взаємодії матричної РНК, транспортної РНК і молекулярного апарату трансляції. AGENTEX зосереджується на зміні саме цих взаємозв’язків, а не на сприйнятті природного коду як незмінного правила.

У межах описаної роботи дослідники вивчали інженерні рибосоми, тРНК та аміноацил-тРНК-синтетази — ферменти, які приєднують амінокислоти до тРНК. Мета полягала в тому, щоб ці компоненти впізнавали одне одного, працювали достатньо точно й водночас були відокремлені від стандартної системи трансляції. Для цього також застосовували автоматизований скринінг бібліотек синтетичних тРНК на здатність правильно аміноацилюватися. 6

Такий підхід дає змогу призначати окремим кодонам інші амінокислоти, зокрема нестандартні, у спеціально зібраній безклітинній реакції. Раніше реконструйовані системи з тРНК, транскрибованими in vitro, уже показали, що трансляція може працювати з перепроєктованими варіантами коду. AGENTEX розширює цей принцип до автоматизованого й мультиплексного робочого процесу для створення прототипів. 5

У наведених матеріалах описано два перепроєктовані генетичні коди, які перевіряли в тій самій загальній експериментальній системі, що й стандартний код. У них перепризначали до трьох кодонів і забезпечували включення нестандартних амінокислот. 8 Оскільки кожен альтернативний варіант складається з сумісного набору компонентів трансляції, дослідники можуть порівнювати різні архітектури кодів, не нав’язуючи одну змінену систему всьому живому геному.

Розробники також описують безклітинні системи, у яких 34 кодони обслуговуються набором із 34 аміноацил-тРНК-синтетаз. Це створює основу для білків із до 34 різних амінокислот. 68

Чому автоматизація має значення

Генетичний код — це не просто таблиця відповідностей. Щоб нове перепризначення запрацювало, потрібні тРНК, які розпізнають правильні кодони, синтетази, що приєднують до них потрібні амінокислоти, і рибосома, яка приймає ці комплекси з достатньою точністю та ефективністю. У безклітинній системі кожен із цих компонентів можна окремо додати, прибрати або замінити. 1516

AGENTEX використовує такий контроль для циклу «спроєктувати — зібрати — перевірити»:

1. Спроєктувати таблицю кодонів і набір компонентів трансляції.
2. Зібрати комбінації тРНК, синтетаз і рибосом у безклітинній реакції.
3. Перевірити аміноацилювання, трансляцію та включення вибраних амінокислот.
4. Порівняти вихід продукту, точність і ортогональність різних систем.
5. Передати далі лише найперспективніші варіанти для складніших біологічних експериментів.

Практична перевага — швидкість і масштаб. Невдалий дизайн можна відкинути як невдалу реакцію, не перетворюючи його на багаторічний проєкт зі створення генетично зміненого організму. Успішний варіант можна вдосконалити до початку редагування геному, конструювання штаму та перевірки його роботи в клітинах. 6

Чого AGENTEX поки не вирішує

AGENTEX демонструє роботу системи трансляції in vitro, але сама по собі не створює життєздатного організму, який міг би підтримувати, відтворювати й регулювати істотно перепроєктований генетичний код.

Для перенесення такого коду в живі клітини потрібно було б подолати щонайменше кілька проблем:

• Сумісність із геномом. Перепризначені кодони, ймовірно, доведеться видалити або замінити в усьому геномі, щоб природні білки не синтезувалися з помилками.
• Контроль компонентів. Інженерні тРНК, синтетази та, можливо, рибосоми мають стабільно працювати поруч із природним апаратом клітини або замість нього.
• Доступність амінокислот. Клітина повинна отримувати чи синтезувати кожну нестандартну амінокислоту та спрямовувати її до потрібного шляху трансляції.
• Вибіркове заряджання тРНК. Синтетази мають приєднувати правильну амінокислоту до правильної тРНК і не вступати в небажані перехресні реакції. 5
• Продуктивність і стабільність. Нова система повинна зберігати прийнятні рівні синтезу білка, точність, ріст клітин і успадкування властивостей упродовж тривалого часу.

Масштаб проблеми ілюструють попередні клітинні дослідження. В одній із недавніх робіт у клітинах ссавців вдалося включити до п’яти різних синтетичних амінокислот в один білок, перепризначивши рідкісні кодони. 4 Це важливий результат для клітинної біології, але він відрізняється від створення стабільного організму, що самовідтворюється й використовує повну 34-амінокислотну систему на кшталт описаної для AGENTEX. Надані матеріали не підтверджують, що такий організм уже створено.

Що може дати платформа

Розширений хімічний алфавіт для білкової інженерії

Природні білки складаються з відносно невеликого набору амінокислот. Гнучкіші генетичні коди дадуть змогу досліджувати білки й пептидні біополімери з хімічними групами, бічними ланцюгами або структурними елементами, недоступними для звичайної трансляції. У звіті про AGENTEX платформу безпосередньо пов’язують із синтезом пептидних біополімерів і створенням генетичних кодів «на вимогу». 6

Нові напрямки пошуку ліків

Нестандартні амінокислоти можуть надавати молекулам властивостей, корисних у розробленні препаратів: зміненої реактивності, підвищеної стабільності або можливості контрольованого приєднання інших сполук. AGENTEX може спростити ранній скринінг великої кількості молекулярних варіантів.

Однак це перевага на етапі відкриття та інженерії, а не доказ того, що конкретний продукт AGENTEX уже є лікарським засобом. Будь-яке терапевтичне застосування потребуватиме стандартної перевірки ефективності, безпеки, доставки та виробництва.

Програмовані матеріали

Рибосомний синтез забезпечує контроль над послідовністю. Якщо поєднати його з ширшим набором хімічних будівельних блоків, можна буде шукати біоматеріали з новими здатностями до зв’язування, каталізу, поглинання світла, механічною міцністю або самозбиранням. Безклітинні системи вже використовували для отримання активних білків із перепроєктованими кодами, що створює основу для таких експериментів. 5

Крок до генетичної ізоляції

Достатньо відмінний генетичний код у майбутньому потенційно міг би ускладнити обмін функціональною генетичною інформацією між інженерними та природними організмами або зробити такі організми менш придатними для звичайних біологічних паразитів. AGENTEX цього не демонструє. Його безпосередній внесок — можливість порівнювати потенційно ортогональні коди ще до значно складнішої спроби встановити один із них у живій системі, здатній до розмноження.

Чим AGENTEX відрізняється від попередніх підходів

Традиційне розширення генетичного коду часто починалося з додавання однієї нестандартної амінокислоти до стоп-кодону або зі звільнення невеликої кількості кодонів після масштабного редагування геному. Інші роботи демонстрували ширші конструкції, зокрема систему з 68 кодонами, здатну включати чотири різні неконанонічні амінокислоти в один білок. Безклітинні дослідження також показували можливість створення «поміняних» або спрощених кодів за допомогою інженерних чи транскрибованих in vitro тРНК. 35

Тому особливість AGENTEX — не лише в кількості амінокислот, а й у самому робочому процесі: автоматизованому мультиплексному створенні прототипів систем трансляції до початку клітинного перепрограмування. Платформа створює проміжний шар між теоретичною схемою генетичного коду та живим організмом. Він може зменшити кількість невдалих спроб, раніше виявляти несумісності й розширити набір архітектур, які реально перевірити.

Головне застереження залишається незмінним: AGENTEX спрощує прототипування альтернативних генетичних кодів, але не усуває біологічних та інженерних труднощів їхньої роботи всередині живих клітин.