Як створили біглів з редагованими генами

Дослідники з Kindred Companion Sciences застосували двоетапний процес, поєднавши редагування генів CRISPR-Cas9 із соматичним ядерним перенесенням (SCNT) — тим самим методом клонування, який використовували для створення вівці Доллі .

Крок 1: Редагування CRISPR у клітинах. Вчені взяли клітини шкіри (фібробласти) з плоду бігля-самиці та за допомогою CRISPR-Cas9 вставили один нуклеотид у перший екзон гена Can f 1. Це спричинило мутацію зсуву рамки зчитування, яка повністю блокує вироблення білка Can f 1 .

Крок 2: Соматичне ядерне перенесення (клонування). Ядра редагованих клітин ввели в без'ядерні яйцеклітини собак. З 25 ембріонів із вимкненим геном Can f 1 два розвинулися до завершення терміну в сурогатній матері, яка народила генетично ідентичних самок біглів — Бейлі та Елфі — у вересні 2024 року .

Результатом стало перше успішне створення собак із цілеспрямованим вимкненням гена Can f 1, опубліковане в рецензованому журналі The CRISPR Journal .

Підтверджувальні тести: нульовий рівень алергену

Численні лабораторні аналізи підтвердили, що генетична модифікація усунула алерген:

• Тести ELISA та Вестерн-блот на слині, шерсті, лупі та екстрактах шкіри собак не виявили жодного білка Can f 1 — його рівень був нижчим за межу кількісного визначення, тоді як у звичайних собак Can f 1 вироблявся у великих кількостях .
• Вимкнення гена виявилося стабільним і повним: жодного сліду основного собачого алергену не знайшли в жодному зі зразків обох цуценят .
• Також провели попередній тест на людині: особа з відомою алергією на собак, яка зазвичай реагує на них, провела час із Бейлі та Елфі й не повідомила про жодні алергічні симптоми. Її алергія не зникла, але реакції на цих конкретних собак не було, оскільки в їхній слині та шерсті просто відсутній ключовий білок .
• Обидві собаки пройшли регулярні ветеринарні огляди, які показали нормальний ріст і розвиток без негативних наслідків для здоров'я станом на дворічний вік .
• Крім того, Kindred повідомляє, що секвенування всього генома не виявило нецільових редагувань .

Обмеження: що ця собака може і чого не може

Can f 1 є головним собачим алергеном, відповідальним приблизно за 60–70% випадків алергії на собак, але собаки продукують щонайменше шість інших відомих алергенів (Can f 2–Can f 7). Люди, алергічні на інші білки, все одно реагуватимуть, і експерти застерігають, що жодна собака не може бути на 100% гіпоалергенною .

Що залишається зробити перед виходом на ринок

Регуляторне схвалення

FDA регулює тварин з редагованими генами як «навмисні геномні зміни» (IGA) в межах ризик-орієнтованого підходу . Kindred ще не отримала схвалення FDA на це редагування; агентство має оцінити безпеку тварин та самої модифікації, перш ніж їх можна буде продавати . Компанія вже почала обговорення з FDA, але жодної формальної заявки ще не схвалено.

Довгостроковий моніторинг здоров'я

Поки що існує лише дві собаки, і їм лише два роки. Експерти зазначають, що довгострокові наслідки вимкнення Can f 1 для здоров'я невідомі — нормальна біологічна функція цього білка в організмі собак досі повністю не вивчена . Засновник Kindred висловлював впевненість на основі експериментів на мишах, що серйозних наслідків не буде, але необхідно виключити позацільові ефекти протягом усього життя собак .

Проблеми комерціалізації

• Масштабування: Клонування SCNT — дорогий і неефективний метод. Компанія планує природним шляхом розводити редагованих собак, щоб створити лінію цуценят без Can f 1, але це потребуватиме кількох поколінь для валідації .
• Різноманіття порід: Наразі редаговано лише біглів. Адаптація методу для інших порід — чи, з часом, котів — потребуватиме додаткових досліджень і нових перенесень ембріонів .
• Вартість: Очікується, що цуценята з редагованими генами коштуватимуть значно дорожче за звичайних собак, принаймні спочатку, що може зробити їх недоступними для багатьох алергіків .

Етичні та екологічні питання

• Добробут тварин: Процес клонування SCNT історично має високий рівень невдач і порушує питання щодо сурогатних матерів та втрати ембріонів. Компанія стверджує, що Бейлі та Елфі здорові, а всі процедури виконувалися з дотриманням норм добробуту тварин, однак ширша етика створення редагованих домашніх улюбленців для зручності людини залишається предметом дискусій .
• Вплив на притулки: Біоетик Артур Каплан з Медичної школи Нью-Йоркського університету (NYU Grossman School of Medicine) застеріг, що інженерні собаки без алергії можуть відвернути людей від адопції безпритульних тварин .
• Непередбачувані наслідки для екосистеми: Введення тварин з редагованими генами в популяцію для розведення може мати невідомі довгострокові наслідки, і деякі етики сумніваються, чи не відкриває створення «дизайнерських» улюбленців для полегшення алергії шлях до менш виправданих редагувань .

Часові рамки

Більшість експертів вважають, що знадобиться ще кілька років — можливо, 5–10 — подальших досліджень безпеки, перевірки FDA та масштабування розведення, перш ніж гіпоалергенні собаки з редагованими генами стануть комерційно доступними . Сама Kindred заявляє, що поки не має дати комерційної доступності для оголошення .

Як створили біглів з редагованими генами

Дослідники з Kindred Companion Sciences застосували двоетапний процес, поєднавши редагування генів CRISPR-Cas9 із соматичним ядерним перенесенням (SCNT) — тим самим методом клонування, який використовували для створення вівці Доллі .

Крок 1: Редагування CRISPR у клітинах. Вчені взяли клітини шкіри (фібробласти) з плоду бігля-самиці та за допомогою CRISPR-Cas9 вставили один нуклеотид у перший екзон гена Can f 1. Це спричинило мутацію зсуву рамки зчитування, яка повністю блокує вироблення білка Can f 1 .

Крок 2: Соматичне ядерне перенесення (клонування). Ядра редагованих клітин ввели в без'ядерні яйцеклітини собак. З 25 ембріонів із вимкненим геном Can f 1 два розвинулися до завершення терміну в сурогатній матері, яка народила генетично ідентичних самок біглів — Бейлі та Елфі — у вересні 2024 року .

Результатом стало перше успішне створення собак із цілеспрямованим вимкненням гена Can f 1, опубліковане в рецензованому журналі The CRISPR Journal .

Підтверджувальні тести: нульовий рівень алергену

Численні лабораторні аналізи підтвердили, що генетична модифікація усунула алерген:

• Тести ELISA та Вестерн-блот на слині, шерсті, лупі та екстрактах шкіри собак не виявили жодного білка Can f 1 — його рівень був нижчим за межу кількісного визначення, тоді як у звичайних собак Can f 1 вироблявся у великих кількостях .
• Вимкнення гена виявилося стабільним і повним: жодного сліду основного собачого алергену не знайшли в жодному зі зразків обох цуценят .
• Також провели попередній тест на людині: особа з відомою алергією на собак, яка зазвичай реагує на них, провела час із Бейлі та Елфі й не повідомила про жодні алергічні симптоми. Її алергія не зникла, але реакції на цих конкретних собак не було, оскільки в їхній слині та шерсті просто відсутній ключовий білок .
• Обидві собаки пройшли регулярні ветеринарні огляди, які показали нормальний ріст і розвиток без негативних наслідків для здоров'я станом на дворічний вік .
• Крім того, Kindred повідомляє, що секвенування всього генома не виявило нецільових редагувань .

Обмеження: що ця собака може і чого не може

Can f 1 є головним собачим алергеном, відповідальним приблизно за 60–70% випадків алергії на собак, але собаки продукують щонайменше шість інших відомих алергенів (Can f 2–Can f 7). Люди, алергічні на інші білки, все одно реагуватимуть, і експерти застерігають, що жодна собака не може бути на 100% гіпоалергенною .

Що залишається зробити перед виходом на ринок

Регуляторне схвалення

FDA регулює тварин з редагованими генами як «навмисні геномні зміни» (IGA) в межах ризик-орієнтованого підходу . Kindred ще не отримала схвалення FDA на це редагування; агентство має оцінити безпеку тварин та самої модифікації, перш ніж їх можна буде продавати . Компанія вже почала обговорення з FDA, але жодної формальної заявки ще не схвалено.

Довгостроковий моніторинг здоров'я

Поки що існує лише дві собаки, і їм лише два роки. Експерти зазначають, що довгострокові наслідки вимкнення Can f 1 для здоров'я невідомі — нормальна біологічна функція цього білка в організмі собак досі повністю не вивчена . Засновник Kindred висловлював впевненість на основі експериментів на мишах, що серйозних наслідків не буде, але необхідно виключити позацільові ефекти протягом усього життя собак .

Проблеми комерціалізації

• Масштабування: Клонування SCNT — дорогий і неефективний метод. Компанія планує природним шляхом розводити редагованих собак, щоб створити лінію цуценят без Can f 1, але це потребуватиме кількох поколінь для валідації .
• Різноманіття порід: Наразі редаговано лише біглів. Адаптація методу для інших порід — чи, з часом, котів — потребуватиме додаткових досліджень і нових перенесень ембріонів .
• Вартість: Очікується, що цуценята з редагованими генами коштуватимуть значно дорожче за звичайних собак, принаймні спочатку, що може зробити їх недоступними для багатьох алергіків .

Етичні та екологічні питання

• Добробут тварин: Процес клонування SCNT історично має високий рівень невдач і порушує питання щодо сурогатних матерів та втрати ембріонів. Компанія стверджує, що Бейлі та Елфі здорові, а всі процедури виконувалися з дотриманням норм добробуту тварин, однак ширша етика створення редагованих домашніх улюбленців для зручності людини залишається предметом дискусій .
• Вплив на притулки: Біоетик Артур Каплан з Медичної школи Нью-Йоркського університету (NYU Grossman School of Medicine) застеріг, що інженерні собаки без алергії можуть відвернути людей від адопції безпритульних тварин .
• Непередбачувані наслідки для екосистеми: Введення тварин з редагованими генами в популяцію для розведення може мати невідомі довгострокові наслідки, і деякі етики сумніваються, чи не відкриває створення «дизайнерських» улюбленців для полегшення алергії шлях до менш виправданих редагувань .

Часові рамки

Більшість експертів вважають, що знадобиться ще кілька років — можливо, 5–10 — подальших досліджень безпеки, перевірки FDA та масштабування розведення, перш ніж гіпоалергенні собаки з редагованими генами стануть комерційно доступними . Сама Kindred заявляє, що поки не має дати комерційної доступності для оголошення .