Інженерна тРНК допомогла обійти генетичну «стоп-команду» при муковісцидозі

Команда під керівництвом дослідників Університету Торонто розробила не вірусний РНК-підхід для муковісцидозу, спричиненого нонсенс-мутаціями — генетичними помилками, які вставляють передчасний сигнал зупинки в інструкції для вироблення білка. Замість редагування гена CFTR науковці ввели інженерну супресорну транспортну РНК (sup-тРНК), здатну розпізнавати цей хибний сигнал і допомагати клітині завершити синтез повнорозмірного білка CFTR. 1

Результати отримано в клітинах бронхіального епітелію, моделях на мишах і пацієнтських органоїдах — лабораторних мінітканинах, вирощених із клітин людей із муковісцидозом. Це перспективна доклінічна платформа, а не доведене лікування для людей.

Коли генетична «крапка» з’являється зарано

Нонсенс-мутація змушує клітинний механізм синтезу білка зупинитися завчасно. У випадку CFTR це може призвести до того, що клітина виробляє дуже мало повнорозмірного білка або не виробляє його зовсім. Без нього порушується робота хлоридного каналу, важливого для нормального стану слизу в дихальних шляхах.

Це має значення для сучасних ліків від муковісцидозу. Модулятори CFTR покращують згортання, транспортування або активність білка, який клітина вже виробила. Але вони не можуть повністю компенсувати ситуацію, коли передчасний стоп-сигнал не дає створити достатню кількість повного білка. Тому новий підхід орієнтований на підгрупу пацієнтів із нонсенс-мутаціями CFTR, яким самих модуляторів може бути недостатньо. 12

За оцінками, нонсенс-мутації спричиняють близько 11% спадкових генетичних розладів. Оскільки подібна помилка трансляції трапляється в різних генах, безпечний механізм її подолання потенційно можна адаптувати й для інших захворювань. 2

Як супресорна тРНК обходить мутацію

У нормі транспортна РНК розпізнає кодони матричної РНК і доставляє до рибосоми відповідні амінокислоти під час синтезу білка. Дослідники змінили супресорні тРНК так, щоб їхні антикодони розпізнавали передчасний стоп-кодон у мутантній матричній РНК CFTR.

Коли така тРНК досягає помилкового сигналу зупинки, вона вставляє амінокислоту замість завершення трансляції. Рибосома продовжує зчитувати інструкцію, і клітина може виробити повнорозмірний CFTR. Інакше кажучи, метод обходить неправильну «стоп-команду», а не виправляє саму послідовність ДНК. 14

Оскільки РНК не призначена для постійної зміни геному, ефект цього підходу є тимчасовим. Якщо технологія дійде до клініки, найімовірніше, знадобляться повторні введення. Їхня частота залежатиме від тривалості дії та безпеки повторного дозування.

Навіщо тРНК хімічно модифікували

Немодифікована супресорна тРНК має подолати одразу кілька перешкод: залишатися стабільною, встигати приєднати правильну амінокислоту, ефективно долати стоп-кодон і не викликати надмірної активації вродженої імунної системи.

Команда внесла до тРНК точкову хімічну модифікацію, яка природно трапляється в молекулах тРНК. За повідомленням дослідників, це покращило аміноацилювання — приєднання амінокислоти до тРНК, — підвищило ефективність «прочитування» передчасного стоп-кодону, подовжило функціональну активність і зменшило активацію вродженого імунітету. Доступні матеріали не називають цю модифікацію, тому її не слід безпідставно ототожнювати, наприклад, із псевдоуридином. 158

Отже, дослідники одночасно працювали над кількома вузькими місцями. ТРНК, яка долає стоп-кодон, але швидко руйнується, погано «заряджається» амінокислотою або сильно стимулює імунну відповідь, мала б обмежену терапевтичну цінність.

Доставка без вірусів — безпосередньо до легень

Для доставки незвично структурованої тРНК науковці розробили ліпідні наночастинки (LNP) зі складом, підібраним під цей вантаж. Вони протестували різні формуляції, оцінили ефективність доставки й обрали частинки, які вводили інгаляційно, щоб зосередити РНК у легеневій тканині та клітинах дихальних шляхів. 18

Це не вірусна система доставки: LNP переносять терапевтичну РНК у клітини, але не використовують вірусний вектор і не вставляють виправлений ген у геном. Попередні дослідження вже показували, що супресорні тРНК у ліпідних наночастинках можуть відновлювати вироблення функціональних білків у мишей, що стало основою для нової конструкції вантажу та легенево-орієнтованої доставки. 4

Що показали клітини, миші та органоїди

Комбінація sup-тРНК і інгаляційних LNP відновила вироблення CFTR та пов’язану з ним роботу хлоридного каналу в кількох експериментальних системах:

• Клітини людського бронхіального епітелію. Лікування сприяло подоланню передчасного стоп-кодону та відновило вироблення повнорозмірного CFTR.
• Моделі муковісцидозу на мишах. Інгаляційна доставка досягала легень і забезпечувала тривалу активність — за повідомленнями, до приблизно 40 днів. Це доклінічний результат, який не можна вважати прогнозом для людей. 16
• Органоїд, отриманий від пацієнта. Підхід відновив повнорозмірний CFTR в органоїді з чотирма варіантами CFTR, зокрема двома нонсенс-варіантами. 18

Водночас саме органоїд продемонстрував важливе обмеження. Новосинтезований CFTR потребував комбінації коректора та потенціатора елексакафтору–тезакафтору–івакафтору, відомої як Trikafta, щоб оптимально згорнутися, дістатися потрібного місця в клітині та працювати як канал. Отже, для частини мутацій логіка лікування може бути такою: спочатку відновити вироблення білка, а потім покращити роботу врятованого CFTR, а не повністю відмовитися від модуляторів. 13

Потенціал для інших спадкових хвороб

Теоретично супресорні тРНК можна розробити для розпізнавання кожного з трьох стоп-кодонів. Це створює платформний підхід: одну загальну технологію можна адаптувати до різних захворювань, якщо вдасться підібрати відповідну тРНК, правильну амінокислоту, достатню дозу для потрібної тканини та безпечний режим трансляції.

Однак така адаптація не відбувається автоматично. Різні білки можуть по-різному переносити заміну амінокислоти, а відновлений після передчасної зупинки білок усе одно може неправильно згортатися або потребувати стабілізувального препарату. Важливим залишається і питання доставки. Формула для інгаляційного введення в легені не обов’язково підійде для печінки, м’язів, мозку чи нирок — для кожного органа можуть знадобитися інші наночастинки та спосіб введення. 34

Які питання безпеки ще потрібно вирішити

Перш ніж перейти від моделей до клінічних випробувань, дослідникам необхідно з’ясувати:

• чи не спричинятиме супресорна тРНК небажане «прочитування» нормальних стоп-кодонів;
• чи не призведе змінена трансляція до утворення шкідливих побічних білків або неправильних амінокислотних замін;
• наскільки безпечним і ефективним буде повторне інгаляційне дозування;
• як широко препарат розподілятиметься в легенях і як довго залишатиметься активним;
• чи можуть LNP або сама РНК викликати запалення чи інші імунні реакції.

У зовнішніх повідомленнях згадувалося дозозалежне запалення у мишей, а також ширші питання респіраторної безпеки інгаляційних LNP-підходів. Це потребує ретельної перевірки, перш ніж технологію можна буде вважати клінічно підтвердженим лікуванням. 613

Головне досягнення роботи — поєднання хімічної інженерії тРНК із доставкою, орієнтованою на конкретний орган. Поліпшивши «прочитування» стоп-кодону, тривалість дії, приєднання амінокислоти та переносимість і водночас спрямовуючи вантаж до легень, дослідники відновили вироблення та функцію CFTR у доклінічних і пацієнтських моделях.

Наступний крок — перевірити, чи можна безпечно, повторно й передбачувано відтворити цей ефект у людей. Також ще належить з’ясувати, для яких мутацій CFTR буде достатньо самої sup-тРНК, а де знадобиться комбіноване лікування з модуляторами або іншими препаратами, що стабілізують білок.