พลาสมิดไม่เสถียร/สูญหายเกิดขึ้นได้หลังการเหนี่ยวนำ ขึ้่นอยู่กับสายพันธุ์โฮสต์ เวกเตอร์ และสภาวะการเพาะเลี้ยง
ในการเปรียบเทียบระบบแสดงออกใน E. coli ที่ใช้ในอุตสาหกรรม พบว่า HMS174(DE3) หยุดการเจริญเติบโตหลังการเหนี่ยวนำแต่ยังคงรักษาพลาสมิดไว้ได้ ในขณะที่ BL21(DE3) และ RV308(DE3) เกิดการสูญเสียพลาสมิด (plasmid loss) และยังคงเติบโตต่อไป
ดังนั้น หากการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายทำให้เซลล์ที่มีพลาสมิดถูกต้องเจริญเติบโตช้า เซลล์ที่แสดงออกน้อยกว่า สูญเสียพลาสมิด หรือกลายพันธุ์ที่ได้เปรียบจะสามารถสะสมตัวใน culture ได้ นี่คือกลไกที่สมเหตุสมผลสำหรับ "การเหนี่ยวนำไม่ได้ผลในครั้งต่อไป" ไม่ใช่ผลโดยตรงและถ่ายทอดทางพันธุกรรมของ IPTG
ความเป็นพิษของโปรตีนเป็นปัจจัยเสี่ยงสำคัญ
ความเป็นพิษของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ใน E. coli เป็นปัญหาที่ทราบกันดี และนำไปสู่การพัฒนาสายพันธุ์ BL21 สายพันธุ์กลาย เช่น C41(DE3) และ C43(DE3) ที่เหมาะสมกว่าสำหรับการแสดงออกโปรตีนที่เป็นพิษ (toxic proteins)
ในแบบจำลอง metabolic engineering ใน BL21(DE3) บางชนิด พบว่า IPTG ร่วมกับสารตั้งต้นที่เป็นพิษทำให้เกิดความเครียดทางสรีรวิทยาอย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม สิ่งนี้ไม่สามารถสรุปได้ว่า "IPTG เป็นพิษเสมอไป" แต่ชี้ให้เห็นว่าสภาวะการเหนี่ยวนำอาจทำให้สภาวะที่เซลล์เครียดอยู่แล้วแย่ลง
ข้อสรุปที่ถูกต้องแม่นยำที่สุดสำหรับปัญหาที่ว่า:
หาก parent cells หลังจากการเหนี่ยวนำข้ามคืนยังคงรักษาพลาสมิดที่สมบูรณ์และองค์ประกอบควบคุมการแสดงออกไว้ได้ และในการเพาะเลี้ยงครั้งใหม่มีจำนวน generation เพียงพอที่จะฟื้นฟูการเจริญเติบโต โดยหลักการแล้วเซลล์รุ่นหลังยังคงสามารถถูกเหนี่ยวนำด้วย IPTG ได้อีกในระยะท้ายของการเพาะเลี้ยงหลัก
แต่วิธีนี้เพิ่มโอกาสที่การแสดงออกจะล้มเหลว ผลผลิตลดลง และ batch-to-batch variation โดยเฉพาะเมื่อใช้ high-copy plasmid, strong promoter, โปรตีนที่เป็นพิษ, การเหนี่ยวนำที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลานาน หรือ IPTG ความเข้มข้นสูง
Mairhofer J, et al. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during recombinant protein production. Microbial Cell Factories. 2013. — เปรียบเทียบการเจริญเติบโตและการสูญเสียพลาสมิดหลัง induction ในหลายโฮสต์
Tripathi NK, et al. Impact of the Expression System on Recombinant Protein Production in Escherichia coli. 2021. — อภิปราย metabolic burden จากการถอดรหัส/แปลรหัสยีนภายนอกและข้อควรพิจารณาในการเลือกระบบ
Kopp J, et al. Optimizing recombinant protein expression via automated induction profiling in Escherichia coli. 2017. — แสดงความสำคัญของความเข้มข้น IPTG อุณหภูมิ และ metabolic burden ต่อการเจริญเติบโตและการแสดงออก
van Loosdrecht MCM, et al. The Impact of IPTG Induction on Plasmid Stability and Heterologous Protein Production. 2020. — ตรวจสอบความสัมพันธ์โดยตรงระหว่าง IPTG induction อัตราการรอดชีวิตของเซลล์ และ plasmid stability
Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 1999; และบทความปริทัศน์ภายหลัง — อธิบายความเสี่ยงของ plasmid loss เมื่อใช้ high-copy plasmid, ยีนที่เป็นพิษหรือลดอัตราการเจริญเติบโต และการเพาะเลี้ยงที่ความหนาแน่นสูง
Mairhofer J, et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3). Microbial Cell Factories. 2015. — ตัวอย่างการทดลองที่ IPTG ทำให้ความเครียดของเซลล์ที่มีอยู่เดิมแย่ลงในบางระบบ
Saida F. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 2004. — บทความปริทัศน์เกี่ยวกับความเป็นพิษของโปรตีนรีคอมบิแนนท์และสายพันธุ์โฮสต์ที่เหมาะสม
ในทางปฏิบัติ หากต้องการตรวจสอบว่าเซลล์ใน batch ของคุณ "สูญเสียความสามารถในการถูกเหนี่ยวนำ" จริงหรือไม่ วิธีที่น่าเชื่อถือที่สุดไม่ใช่การคาดเดาทางทฤษฎี แต่ควรสุ่ม single colony จาก culture ใหม่: ยืนยันการดื้อยาปฏิชีวนะ ทำ plasmid restriction digest / sequencing และทดสอบการเหนี่ยวนำด้วย IPTG ที่ OD และสภาวะเดียวกัน โดยมี seed control ที่ยังไม่ถูกเหนี่ยวนำ จากนั้นตรวจสอบด้วย SDS-PAGE หรือ Western blot
พลาสมิดไม่เสถียร/สูญหายเกิดขึ้นได้หลังการเหนี่ยวนำ ขึ้่นอยู่กับสายพันธุ์โฮสต์ เวกเตอร์ และสภาวะการเพาะเลี้ยง
ในการเปรียบเทียบระบบแสดงออกใน E. coli ที่ใช้ในอุตสาหกรรม พบว่า HMS174(DE3) หยุดการเจริญเติบโตหลังการเหนี่ยวนำแต่ยังคงรักษาพลาสมิดไว้ได้ ในขณะที่ BL21(DE3) และ RV308(DE3) เกิดการสูญเสียพลาสมิด (plasmid loss) และยังคงเติบโตต่อไป
ดังนั้น หากการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายทำให้เซลล์ที่มีพลาสมิดถูกต้องเจริญเติบโตช้า เซลล์ที่แสดงออกน้อยกว่า สูญเสียพลาสมิด หรือกลายพันธุ์ที่ได้เปรียบจะสามารถสะสมตัวใน culture ได้ นี่คือกลไกที่สมเหตุสมผลสำหรับ "การเหนี่ยวนำไม่ได้ผลในครั้งต่อไป" ไม่ใช่ผลโดยตรงและถ่ายทอดทางพันธุกรรมของ IPTG
ความเป็นพิษของโปรตีนเป็นปัจจัยเสี่ยงสำคัญ
ความเป็นพิษของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ใน E. coli เป็นปัญหาที่ทราบกันดี และนำไปสู่การพัฒนาสายพันธุ์ BL21 สายพันธุ์กลาย เช่น C41(DE3) และ C43(DE3) ที่เหมาะสมกว่าสำหรับการแสดงออกโปรตีนที่เป็นพิษ (toxic proteins)
ในแบบจำลอง metabolic engineering ใน BL21(DE3) บางชนิด พบว่า IPTG ร่วมกับสารตั้งต้นที่เป็นพิษทำให้เกิดความเครียดทางสรีรวิทยาอย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม สิ่งนี้ไม่สามารถสรุปได้ว่า "IPTG เป็นพิษเสมอไป" แต่ชี้ให้เห็นว่าสภาวะการเหนี่ยวนำอาจทำให้สภาวะที่เซลล์เครียดอยู่แล้วแย่ลง
ข้อสรุปที่ถูกต้องแม่นยำที่สุดสำหรับปัญหาที่ว่า:
หาก parent cells หลังจากการเหนี่ยวนำข้ามคืนยังคงรักษาพลาสมิดที่สมบูรณ์และองค์ประกอบควบคุมการแสดงออกไว้ได้ และในการเพาะเลี้ยงครั้งใหม่มีจำนวน generation เพียงพอที่จะฟื้นฟูการเจริญเติบโต โดยหลักการแล้วเซลล์รุ่นหลังยังคงสามารถถูกเหนี่ยวนำด้วย IPTG ได้อีกในระยะท้ายของการเพาะเลี้ยงหลัก
แต่วิธีนี้เพิ่มโอกาสที่การแสดงออกจะล้มเหลว ผลผลิตลดลง และ batch-to-batch variation โดยเฉพาะเมื่อใช้ high-copy plasmid, strong promoter, โปรตีนที่เป็นพิษ, การเหนี่ยวนำที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลานาน หรือ IPTG ความเข้มข้นสูง
Mairhofer J, et al. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during recombinant protein production. Microbial Cell Factories. 2013. — เปรียบเทียบการเจริญเติบโตและการสูญเสียพลาสมิดหลัง induction ในหลายโฮสต์
Tripathi NK, et al. Impact of the Expression System on Recombinant Protein Production in Escherichia coli. 2021. — อภิปราย metabolic burden จากการถอดรหัส/แปลรหัสยีนภายนอกและข้อควรพิจารณาในการเลือกระบบ
Kopp J, et al. Optimizing recombinant protein expression via automated induction profiling in Escherichia coli. 2017. — แสดงความสำคัญของความเข้มข้น IPTG อุณหภูมิ และ metabolic burden ต่อการเจริญเติบโตและการแสดงออก
van Loosdrecht MCM, et al. The Impact of IPTG Induction on Plasmid Stability and Heterologous Protein Production. 2020. — ตรวจสอบความสัมพันธ์โดยตรงระหว่าง IPTG induction อัตราการรอดชีวิตของเซลล์ และ plasmid stability
Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 1999; และบทความปริทัศน์ภายหลัง — อธิบายความเสี่ยงของ plasmid loss เมื่อใช้ high-copy plasmid, ยีนที่เป็นพิษหรือลดอัตราการเจริญเติบโต และการเพาะเลี้ยงที่ความหนาแน่นสูง
Mairhofer J, et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3). Microbial Cell Factories. 2015. — ตัวอย่างการทดลองที่ IPTG ทำให้ความเครียดของเซลล์ที่มีอยู่เดิมแย่ลงในบางระบบ
Saida F. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 2004. — บทความปริทัศน์เกี่ยวกับความเป็นพิษของโปรตีนรีคอมบิแนนท์และสายพันธุ์โฮสต์ที่เหมาะสม
ในทางปฏิบัติ หากต้องการตรวจสอบว่าเซลล์ใน batch ของคุณ "สูญเสียความสามารถในการถูกเหนี่ยวนำ" จริงหรือไม่ วิธีที่น่าเชื่อถือที่สุดไม่ใช่การคาดเดาทางทฤษฎี แต่ควรสุ่ม single colony จาก culture ใหม่: ยืนยันการดื้อยาปฏิชีวนะ ทำ plasmid restriction digest / sequencing และทดสอบการเหนี่ยวนำด้วย IPTG ที่ OD และสภาวะเดียวกัน โดยมี seed control ที่ยังไม่ถูกเหนี่ยวนำ จากนั้นตรวจสอบด้วย SDS-PAGE หรือ Western blot