หลักฐานทางวิทยาศาสตร์: IPTG ทำให้เซลล์สูญเสียความสามารถในการถูกเหนี่ยวนำอีกครั้งหรือไม่?

มีข้อมูลใหม่ที่ถูกต้องกว่าที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ 文献สนับสนุนอย่างชัดเจนว่า การเหนี่ยวนำที่ทำให้เกิดการแสดงออกสูงจะสร้างภาระทางเมแทบอลิซึม (metabolic burden) และอาจทำให้พลาสมิดไม่เสถียรหรือเกิดการคัดเลือกประชากรที่แสดงออกน้อย แต่ ไม่มีหลักฐานว่าเซลล์ที่เคยสัมผัส IPTG เพียงครั้งเดียวจะสูญเสียความสามารถในการถูกเหนี่ยวนำอีกครั้งอย่างถาวรในทุกรุ่นลูก การสูญเสียความสามารถนี้จะเกิดขึ้นได้ก็ต่อเมื่อมีการสูญเสียพลาสมิดจริง หรือมีการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม/การควบคุมการแสดงออกเท่านั้น

• การเหนี่ยวนำและการแสดงออกโปรตีนสูงลดอัตราการเจริญเติบโตและการรอดชีวิต
  การศึกษาในระบบ IPTG-inducible พบว่าการเหนี่ยวนำด้วย IPTG ส่งผลเสียต่อการเจริญเติบโตและการรอดชีวิตของเซลล์ planktonic และการรักษาพลาสมิดไว้ที่ copy number สูงยังสร้าง metabolic burden ที่จำกัดการแสดงออกโปรตีนจากต่างชนิด
  งานวิจัยอื่น ๆ แสดงให้เห็นว่าภาระจากการถอดรหัสและแปลรหัสของยีนจากภายนอกลดประสิทธิภาพการแสดงออก และที่อุณหภูมิสูงร่วมกับ IPTG ความเข้มข้นสูงจะส่งผลต่อการเจริญเติบโตและการหายใจของเซลล์อย่างชัดเจนยิ่งขึ้น

• พลาสมิดไม่เสถียร/สูญหายเกิดขึ้นได้หลังการเหนี่ยวนำ ขึ้่นอยู่กับสายพันธุ์โฮสต์ เวกเตอร์ และสภาวะการเพาะเลี้ยง
  ในการเปรียบเทียบระบบแสดงออกใน E. coli ที่ใช้ในอุตสาหกรรม พบว่า HMS174(DE3) หยุดการเจริญเติบโตหลังการเหนี่ยวนำแต่ยังคงรักษาพลาสมิดไว้ได้ ในขณะที่ BL21(DE3) และ RV308(DE3) เกิดการสูญเสียพลาสมิด (plasmid loss) และยังคงเติบโตต่อไป
  ดังนั้น หากการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายทำให้เซลล์ที่มีพลาสมิดถูกต้องเจริญเติบโตช้า เซลล์ที่แสดงออกน้อยกว่า สูญเสียพลาสมิด หรือกลายพันธุ์ที่ได้เปรียบจะสามารถสะสมตัวใน culture ได้ นี่คือกลไกที่สมเหตุสมผลสำหรับ "การเหนี่ยวนำไม่ได้ผลในครั้งต่อไป" ไม่ใช่ผลโดยตรงและถ่ายทอดทางพันธุกรรมของ IPTG

• ความเป็นพิษของโปรตีนเป็นปัจจัยเสี่ยงสำคัญ
  ความเป็นพิษของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ใน E. coli เป็นปัญหาที่ทราบกันดี และนำไปสู่การพัฒนาสายพันธุ์ BL21 สายพันธุ์กลาย เช่น C41(DE3) และ C43(DE3) ที่เหมาะสมกว่าสำหรับการแสดงออกโปรตีนที่เป็นพิษ (toxic proteins)
  ในแบบจำลอง metabolic engineering ใน BL21(DE3) บางชนิด พบว่า IPTG ร่วมกับสารตั้งต้นที่เป็นพิษทำให้เกิดความเครียดทางสรีรวิทยาอย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม สิ่งนี้ไม่สามารถสรุปได้ว่า "IPTG เป็นพิษเสมอไป" แต่ชี้ให้เห็นว่าสภาวะการเหนี่ยวนำอาจทำให้สภาวะที่เซลล์เครียดอยู่แล้วแย่ลง

• ข้อสรุปที่ถูกต้องแม่นยำที่สุดสำหรับปัญหาที่ว่า:
  หาก parent cells หลังจากการเหนี่ยวนำข้ามคืนยังคงรักษาพลาสมิดที่สมบูรณ์และองค์ประกอบควบคุมการแสดงออกไว้ได้ และในการเพาะเลี้ยงครั้งใหม่มีจำนวน generation เพียงพอที่จะฟื้นฟูการเจริญเติบโต โดยหลักการแล้วเซลล์รุ่นหลังยังคงสามารถถูกเหนี่ยวนำด้วย IPTG ได้อีกในระยะท้ายของการเพาะเลี้ยงหลัก
  แต่วิธีนี้เพิ่มโอกาสที่การแสดงออกจะล้มเหลว ผลผลิตลดลง และ batch-to-batch variation โดยเฉพาะเมื่อใช้ high-copy plasmid, strong promoter, โปรตีนที่เป็นพิษ, การเหนี่ยวนำที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลานาน หรือ IPTG ความเข้มข้นสูง

文献แนะนำสำหรับการอ้างอิง

1. Mairhofer J, et al. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during recombinant protein production. Microbial Cell Factories. 2013. — เปรียบเทียบการเจริญเติบโตและการสูญเสียพลาสมิดหลัง induction ในหลายโฮสต์

2. Tripathi NK, et al. Impact of the Expression System on Recombinant Protein Production in Escherichia coli. 2021. — อภิปราย metabolic burden จากการถอดรหัส/แปลรหัสยีนภายนอกและข้อควรพิจารณาในการเลือกระบบ

3. Kopp J, et al. Optimizing recombinant protein expression via automated induction profiling in Escherichia coli. 2017. — แสดงความสำคัญของความเข้มข้น IPTG อุณหภูมิ และ metabolic burden ต่อการเจริญเติบโตและการแสดงออก

4. van Loosdrecht MCM, et al. The Impact of IPTG Induction on Plasmid Stability and Heterologous Protein Production. 2020. — ตรวจสอบความสัมพันธ์โดยตรงระหว่าง IPTG induction อัตราการรอดชีวิตของเซลล์ และ plasmid stability

5. Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 1999; และบทความปริทัศน์ภายหลัง — อธิบายความเสี่ยงของ plasmid loss เมื่อใช้ high-copy plasmid, ยีนที่เป็นพิษหรือลดอัตราการเจริญเติบโต และการเพาะเลี้ยงที่ความหนาแน่นสูง

6. Mairhofer J, et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3). Microbial Cell Factories. 2015. — ตัวอย่างการทดลองที่ IPTG ทำให้ความเครียดของเซลล์ที่มีอยู่เดิมแย่ลงในบางระบบ

7. Saida F. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 2004. — บทความปริทัศน์เกี่ยวกับความเป็นพิษของโปรตีนรีคอมบิแนนท์และสายพันธุ์โฮสต์ที่เหมาะสม

ในทางปฏิบัติ หากต้องการตรวจสอบว่าเซลล์ใน batch ของคุณ "สูญเสียความสามารถในการถูกเหนี่ยวนำ" จริงหรือไม่ วิธีที่น่าเชื่อถือที่สุดไม่ใช่การคาดเดาทางทฤษฎี แต่ควรสุ่ม single colony จาก culture ใหม่: ยืนยันการดื้อยาปฏิชีวนะ ทำ plasmid restriction digest / sequencing และทดสอบการเหนี่ยวนำด้วย IPTG ที่ OD และสภาวะเดียวกัน โดยมี seed control ที่ยังไม่ถูกเหนี่ยวนำ จากนั้นตรวจสอบด้วย SDS-PAGE หรือ Western blot