นักวิทยาศาสตร์ติดตาม RNA Polymerase II ในเซลล์มีชีวิต เผยภาพใหม่ของการถอดรหัสยีน

แทนที่จะพยายามมองการหมุนเล็กจิ๋วของ DNA หรือโพลิเมอเรสโดยตรง นักวิจัยติดโครงสร้างโรเตอร์ที่ใหญ่กว่ามากเข้าไปกับระบบ DNA–โปรตีน เมื่อโพลิเมอเรสเคลื่อนที่ การเคลื่อนไหวดังกล่าวจึงถูกขยายให้เห็นได้ชัดขึ้น

ในการประยุกต์ใช้กับการถอดรหัสครั้งแรก ORBIT ตรวจพบขั้นการหมุนที่สอดคล้องกับการคลายเกลียวของคู่เบสทีละคู่ เทคนิคนี้ติดตามได้ในระดับมิลลิวินาที และแยกการหมุนของคู่เบสเดี่ยวที่ประมาณ 34.6 องศาได้

รายละเอียดเชิงกลเช่นนี้ให้ข้อมูลที่การวัดการจับแบบทั่วไปไม่สามารถบอกได้ การวัดเวลาที่เอนไซม์เกาะอยู่กับ DNA อาจบอกได้เพียงว่าเอนไซม์ยังคงอยู่ แต่โรเตอร์ที่ติดตามการหมุนช่วยเผยว่าโพลิเมอเรสเคลื่อนที่เป็นขั้น ๆ หรือไม่ มีการหยุด ถอยกลับ หรือเปลี่ยนสถานะเชิงกลระหว่างการถอดรหัสอย่างไร

dye-cycling ORBIT แก้ปัญหาสีย้อมเรืองแสงดับลง

ข้อจำกัดสำคัญของการติดฉลากเรืองแสงแบบถาวรคือ การฟอกจางของแสง หรือ photobleaching เมื่อสีย้อมสูญเสียความสามารถในการเรืองแสง มันก็ไม่สามารถรายงานการเคลื่อนไหวของโมเลกุลต่อไปได้

dye-cycling ORBIT แก้ปัญหานี้ด้วยการใส่ลำดับ DNA สายเดี่ยวไว้บนโรเตอร์ DNA origami ลำดับเหล่านี้ทำหน้าที่เหมือน “จุดจอด” สำหรับโพรบเรืองแสง โอลิโกนิวคลีโอไทด์สายสั้นที่ติดสีย้อมจะเข้ามาจับจากสารละลาย ส่งสัญญาณเรืองแสง แล้วหลุดออก ก่อนที่โพรบตัวใหม่จะเข้ามาแทนที่

เมื่อสีย้อมถูกเติมกลับอย่างต่อเนื่องแทนที่จะติดอยู่กับโรเตอร์เพียงตัวเดียว โรเตอร์จึงยังสามารถถูกติดตามได้นานขึ้นอย่างมาก วิธีนี้พัฒนาขึ้นเพื่อศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับ DNA ให้พ้นช่วงเวลาปกติที่มักจำกัดอยู่เพียงไม่กี่วินาทีถึงไม่กี่นาที และแสดงการสังเกตได้นานกว่า 10 นาที โดยยังคงความละเอียดระดับคู่เบสเดี่ยวไว้

ในการทดลองการถอดรหัส นักวิจัยใช้วิธีนี้ติดตามการหมุนของ RNA polymerase จากแบคทีเรีย E. coli เป็นเวลานานขึ้น ผลลัพธ์จึงไม่ใช่เพียง “วิดีโอที่ยาวกว่าเดิม” แต่เป็นการเปิดโอกาสให้จับเหตุการณ์ที่เกิดขึ้นไม่บ่อย เช่น การหยุดชั่วคราว การถอยหลังตามแนว DNA และการเปลี่ยนผ่านระหว่างสถานะเชิงกลต่าง ๆ

สองวิธีนี้เสริมกันอย่างไร

ทั้งสองเทคนิคทำงานในระดับการทดลองที่แตกต่างกันอย่างชัดเจน

• การถ่ายภาพ Pol II ในเซลล์มีชีวิต วัดการเข้าจับโครมาตินและระยะเวลาที่เอนไซม์คงอยู่ในเซลล์มนุษย์ที่ยังทำงานตามปกติ
• dye-cycling ORBIT วัดกลไกการหมุนของปฏิสัมพันธ์ระหว่างโพลิเมอเรสกับ DNA ด้วยความละเอียดระดับคู่เบสเดี่ยว และติดตามได้นานขึ้นในระบบที่ควบคุมได้

หลักฐานที่มีอยู่ระบุว่าการประยุกต์ใช้ dye-cycling ORBIT กับการถอดรหัสเป็นการวัด DNA–โพลิเมอเรสระดับโมเลกุลเดี่ยวในระบบควบคุม ไม่ใช่การติดตาม Pol II ของยูคาริโอตแบบเรียลไทม์โดยตรงภายในเซลล์มีชีวิต ดังนั้นจึงไม่ควรนำเสนอว่า ORBIT ได้ผสานการอ่านกลไกเชิงกลเข้ากับการถ่ายภาพ Pol II ในเซลล์ยูคาริโอตแล้ว

สิ่งที่ทั้งสองเทคนิคชี้ให้เห็นคือความเป็นไปได้ของการผสานวิธีในอนาคต การวัดในเซลล์มีชีวิตอาจบอกได้ว่า Pol II เข้าสู่ หยุดอยู่ใน หรือออกจากภาวะการถอดรหัสที่ดำเนินต่อเนื่องเมื่อใด ส่วนตัวรายงานเชิงกลที่ติดตามได้นานขึ้นอาจช่วยอธิบายการเคลื่อนไหวระดับโมเลกุลที่อยู่เบื้องหลังภาวะเหล่านั้น หากในอนาคตสามารถปรับวิธีติดฉลากให้เหมาะกับความซับซ้อนและข้อจำกัดของนิวเคลียสยูคาริโอตที่มีชีวิตได้

ความหมายต่อการศึกษาการควบคุมยีน

ที่ผ่านมา นักวิทยาศาสตร์ศึกษาการถอดรหัสโดยประกอบข้อมูลจากหลายวิธี ทั้งปฏิกิริยาชีวเคมีที่ใช้โมเลกุลบริสุทธิ์ เทคนิคโครงสร้างอย่าง cryo-electron microscopy การวิเคราะห์จีโนมในระดับประชากร และการถ่ายภาพด้วยฟลูออเรสเซนซ์ ความก้าวหน้าครั้งใหม่นี้เติมข้อมูลระดับโมเลกุลเดี่ยวที่ติดตามตามเวลาเข้าไปในชุดเครื่องมือดังกล่าว

การติดตาม Pol II ในเซลล์มีชีวิตแสดงให้เห็นว่าการเข้าจับโครมาตินแต่ละครั้งไม่ได้หมายความว่าเอนไซม์จะเข้าสู่การถอดรหัสอย่างต่อเนื่องเสมอไป ขณะที่ dye-cycling ORBIT แสดงให้เห็นว่า DNA origami และโพรบเรืองแสงแบบเปลี่ยนได้สามารถยืดเวลาการสังเกตกลไกของโพลิเมอเรสให้ยาวกว่าช่วงชีวิตของสีย้อมทั่วไป

เป้าหมายระยะยาวคือการสร้างภาพคำอธิบายของการควบคุมยีนที่ครบถ้วนขึ้น ซึ่งเชื่อมโยงบริบทภายในเซลล์ จลนพลศาสตร์การจับ การเคลื่อนที่เชิงกล การหยุดชั่วคราว และการยืดสาย RNA ไว้ในเรื่องราวระดับโมเลกุลเดียวกัน

ข้อสรุปที่หนักแน่นที่สุดในตอนนี้จึงไม่ใช่คำกล่าวเกินจริง แต่คือความเสริมกันของสองวิธี: วิธีหนึ่งเผยว่า Pol II เข้าจับจีโนมเมื่อใดในเซลล์มีชีวิต ส่วนอีกวิธีเผยว่า โพลิเมอเรสเคลื่อนที่ไปตาม DNA อย่างไรนานพอที่จะจับเหตุการณ์เชิงกลที่เกิดขึ้นได้ยาก