AGENTEX testar nya genetiska koder – utan att skriva om en enda cell

AGENTEX, en förkortning av Automated Genetic tRNA Expansion, ändrar ordningsföljden i arbetet med att konstruera genetiska koder. I stället för att först skriva om en organisms genom och därefter upptäcka om det nya translationssystemet fungerar, kan forskare sätta ihop kandidatsystem i provrör, testa dem robotiserat och använda de bästa designerna som utgångspunkt för senare försök i levande celler. 6

Det rapporterade arbetet stödjer system som kan använda upp till 34 aminosyrabyggstenar, jämfört med de 20 som ingår i den vanliga biologiska koden. 7 Det centrala genombrottet är inte att skapa fler än 64 kodon, utan att göra fler av dessa kodon användbara i alternativa tilldelningar.

Problemet med den vanliga genetiska koden

Den genetiska koden kopplar 64 möjliga tripletter – kodon – till aminosyror samt start- och stoppsignaler. Flera kodon är redundanta och anger samma aminosyra. Just denna redundans skapar utrymme för omprogrammering.

I en levande cell är det däremot riskfyllt att ändra betydelsen av ett kodon. Samma kodon kan förekomma i många centrala gener. Om det plötsligt börjar betyda en annan aminosyra kan resultatet bli omfattande felöversättning av proteiner. Ett cellulärt projekt kan därför kräva att alla förekomster av kodonet ersätts eller tas bort ur genomet – samtidigt som cellens vanliga translationsmaskineri måste hindras från att konkurrera med det konstruerade systemet.

AGENTEX flyttar det första testet ut ur cellen. Forskarna kan tillföra en skräddarsydd uppsättning translationskomponenter och se om en föreslagen karta mellan kodon och aminosyra faktiskt ger rätt protein eller peptid, innan de tar sig an en genomomfattande förändring. 615

Så fungerar de omdesignade koderna

Ett kodon tolkas genom samspelet mellan budbärar-RNA, transfer-RNA – tRNA – och övriga delar av translationsmaskineriet. AGENTEX fokuserar på att förändra dessa molekylära relationer, i stället för att behandla den naturliga koden som oföränderlig.

I plattformens rapporterade arbete undersöktes konstruerade ribosomer, tRNA-molekyler och aminoacyl-tRNA-syntetaser, alltså enzymerna som laddar tRNA med rätt aminosyra. Målet var att komponenterna skulle känna igen varandra, men samtidigt hållas åtskilda från det vanliga translationssystemet. Forskarna använde också automatiserade metoder för att testa bibliotek av syntetiska tRNA-molekyler och se vilka som laddades med aminosyror. 6

På så sätt kan utvalda kodon tilldelas andra aminosyror, inklusive icke-standardiserade aminosyror, i en medvetet återuppbyggd cellfri reaktion. Tidigare cellfria system med tRNA som transkriberats in vitro hade redan visat att proteinsyntes kan fungera med förenklade eller omdesignade genetiska koder. AGENTEX bygger vidare på den principen genom att göra prototypingen parallell och automatiserad. 5

Det material som ligger till grund för rapporteringen beskriver två omdesignade genetiska koder som testades tillsammans med den vanliga koden. Upp till tre kodon omfördelades och icke-standardiserade aminosyror byggdes in i produkterna. 8 Eftersom varje alternativt system bygger på kompatibla translationskomponenter kan flera koddesigner utvärderas inom samma experimentella ramverk, utan att en ny tolkning behöver tvingas på ett levande genom.

Därför spelar robotiseringen roll

En genetisk kod är inte bara en tabell. För att en ny kodontilldelning ska fungera måste rätt tRNA känna igen rätt kodon, rätt syntetas ladda tRNA:t med rätt aminosyra och ribosomen ta emot komplexet med tillräcklig precision och effektivitet. I cellfria translationssystem kan forskarna lägga till, ta bort eller byta ut dessa komponenter var för sig. 1516

AGENTEX använder den kontrollen i en design–bygg–test-cykel:

1. Designa en möjlig kodontabell och de translationskomponenter som behövs.
2. Bygga kombinationer av tRNA, syntetaser och ribosomer i en cellfri reaktion.
3. Testa laddning av tRNA, proteinsyntes och inkorporering av de utvalda aminosyrorna.
4. Jämföra utbyte, noggrannhet och ortogonalitet – alltså hur väl det nya systemet fungerar utan att blanda sig med det vanliga.
5. Gå vidare med endast de mest lovande designerna till mer krävande biologiska experiment.

Den praktiska vinsten är större hastighet och fler testade alternativ. En misslyckad design kan kasseras som en misslyckad reaktion i stället för att bli ett misslyckat projekt med en ombyggd organism. En fungerande design kan finjusteras innan forskarna investerar i genomredigering, framställning av nya cellinjer eller stammar och biologisk validering. 6

Vad AGENTEX ännu inte har löst

AGENTEX visar ett translationssystem in vitro. Plattformen skapar inte i sig en livskraftig organism som kan underhålla, kopiera och reglera en kraftigt omdesignad genetisk kod.

Att flytta en sådan kod in i levande celler skulle fortfarande kräva flera svåra steg:

• Kompatibilitet i hela genomet: Kodon som fått ny betydelse kan behöva tas bort eller ersättas överallt i genomet för att cellens vanliga proteiner inte ska felöversättas.
• Kontroll över komponenterna: Konstruerade tRNA-molekyler, syntetaser och eventuellt ribosomer måste fungera tillförlitligt tillsammans med – eller i stället för – cellens ursprungliga maskineri.
• Tillgång till aminosyror: Cellen måste kunna tillverka eller ta upp varje icke-standardiserad aminosyra och leverera den till rätt translationsväg.
• Selektiv laddning: Syntetaserna måste ladda rätt aminosyra på rätt tRNA och undvika oönskade korsreaktioner. 5
• Biologisk prestanda: Det omdesignade systemet måste ge tillräcklig proteinmängd och precision utan att försämra cellens tillväxt eller förmåga att överleva och föröka sig över tid.

Tidigare studier i levande celler visar hur omfattande utmaningen är. Ett nyligen rapporterat system i däggdjursceller kunde bygga in upp till fem olika syntetiska aminosyror i ett och samma protein genom att återanvända sällsynta kodon. 4 Det är ett betydande cellulärt resultat, men något annat än att visa upp en stabil, självförökande organism som använder en AGENTEX-liknande kod med 34 aminosyror. Det tillgängliga materialet visar inte att en sådan organism har byggts.

Möjliga användningsområden

Större kemiska alfabet för proteinforskning

Naturliga proteiner byggs av en jämförelsevis liten uppsättning aminosyror. Mer flexibla genetiska koder kan låta forskare utforska proteiner och peptidbaserade biomaterial med kemiska grupper, sidokedjor eller ryggradsstrukturer som vanlig proteinsyntes inte kan hantera. AGENTEX-rapporten kopplar uttryckligen plattformen till syntes av peptidbiopolymerer och utveckling av genetiska koder på beställning. 6

Nya kandidater i läkemedelsutveckling

Icke-standardiserade aminosyror kan ge egenskaper som är intressanta i tidiga läkemedelsprojekt, exempelvis förändrad reaktivitet, ökad stabilitet eller möjligheter till kontrollerad koppling av andra molekyler. AGENTEX kan göra det enklare att sålla bland många molekylära konstruktioner tidigt i processen.

Det är dock en fördel i upptäckts- och utvecklingsarbetet – inte ett bevis på att någon AGENTEX-produkt redan är ett läkemedel. En framtida medicinsk användning skulle fortfarande kräva sedvanliga tester av effekt, säkerhet, leverans och tillverkning.

Programmerbara material

Ribosombaserad proteinsyntes ger kontroll över molekylens sekvens. Om denna kontroll kombineras med ett bredare urval av kemiska byggstenar kan forskare undersöka biomaterial med nya bindande, katalytiska, optiska, mekaniska eller självorganiserande egenskaper. Cellfria system har redan använts för att framställa aktiva proteiner med omdesignade kodarrangemang, vilket ger en grund för denna typ av experiment. 5

Ett möjligt steg mot genetisk isolering

En tillräckligt annorlunda genetisk kod skulle i framtiden kunna göra det svårare för konstruerade organismer att utbyta fungerande genetisk information med naturliga organismer eller att fungera som värdar för vanliga biologiska parasiter. AGENTEX visar inte att detta mål är uppnått.

Det mer omedelbara bidraget är att forskare kan jämföra alternativa, ortogonala koder innan de försöker installera en av dem i ett levande system som kan föröka sig. Om en organism längre fram skulle byggas med en kraftigt omfördelad kod kan den i princip bli mer genetiskt isolerad från naturligt liv – men det är fortfarande ett separat och betydligt svårare mål.

Hur AGENTEX skiljer sig från tidigare metoder

Traditionell expansion av den genetiska koden börjar ofta med att en icke-standardiserad aminosyra tilldelas ett stoppkodon, eller med att ett litet antal kodon frigörs genom omfattande genomredigering. Andra arbeten har visat bredare konstruktioner, bland annat ett system med 68 kodon som kunde bygga in fyra olika icke-kanoniska aminosyror i samma protein. Cellfria studier har också skapat utbytta eller förenklade koder med hjälp av konstruerade eller in vitro-transkriberade tRNA-molekyler. 35

AGENTEX:s tydligaste särdrag är därför arbetsflödet lika mycket som antalet aminosyror: robotiserad och parallell prototyping av translationssystem innan en kod installeras i en cell. Plattformen fungerar som ett testlager mellan en teoretisk koddesign och en levande organism.

Det kan minska risken för bortkastat arbete, avslöja inkompatibiliteter tidigare och öka antalet kodarkitekturer som forskarna hinner undersöka. Den viktiga brasklappen är samtidigt att AGENTEX gör alternativa genetiska koder enklare att prototypa – inte att de biologiska och tekniska problemen med att köra dem i levande celler försvinner.