Ett biologiskt kringgående kan hjälpa celler förbi genetiska stoppfel

Ett forskarlag lett från University of Toronto har utvecklat en icke-viral RNA-strategi för cystisk fibros som orsakas av nonsensmutationer – genetiska fel som lägger in en för tidig stoppsignal i instruktionerna för ett protein. I stället för att redigera CFTR-genen tillförde forskarna ett konstruerat suppressor-tRNA, eller sup-tRNA, som kan läsa förbi den felaktiga signalen och hjälpa cellen att tillverka ett fullängds-CFTR-protein. 1

Metoden testades i bronkiala epitelceller, musmodeller och patientbaserade organoider från personer med cystisk fibros. Resultaten är lovande, men det handlar fortfarande om preklinisk forskning – inte om en beprövad behandling för människor.

När en stoppsignal kommer för tidigt

En nonsensmutation får cellens proteinsyntes att avslutas för tidigt. I CFTR-genen kan resultatet bli att cellerna producerar mycket lite, eller inget, fullängdsprotein som kan fungera som en kloridkanal.

Det är en viktig skillnad jämfört med vad dagens CFTR-modulatorer gör. Sådana läkemedel kan förbättra veckning, transport eller aktivitet hos det CFTR-protein som faktiskt har bildats. De kan däremot inte fullt ut kompensera för en mutation som hindrar cellen från att tillverka tillräckligt mycket komplett protein. Studien riktar sig därför mot en undergrupp med CFTR-nonsensmutationer som inte alltid får tillräcklig effekt av modulatorer ensamma. 12

Nonsensmutationer uppskattas stå bakom omkring 11 procent av ärftliga genetiska sjukdomar. Eftersom samma typ av översättningsfel kan uppstå i många olika gener kan en säker metod för att läsa förbi stoppkodon i framtiden få användning även utanför cystisk fibros. 2

Så fungerar suppressor-tRNA

Transfer-RNA, tRNA, hjälper normalt cellen att koppla rätt aminosyra till varje kodon i budbärar-RNA under proteinsyntesen. Forskarna konstruerade sup-tRNA med antikodon som känner igen ett för tidigt stoppkodon i budbärar-RNA från den förändrade CFTR-genen.

När sup-tRNA når den felaktiga stoppsignalen sätts en aminosyra in i stället för att proteinsyntesen avslutas. Ribosomen kan då fortsätta läsa instruktionen och tillverka ett fullängds-CFTR-protein. Strategin kringgår alltså den felplacerade stoppinstruktionen i stället för att reparera själva DNA-sekvensen. 14

Eftersom RNA:t inte är avsett att förändra arvsmassan permanent är effekten övergående. Om metoden någon gång utvecklas till en klinisk behandling skulle upprepade doser sannolikt behövas, även om dosintervallet beror på hur länge effekten varar och hur säkert behandlingen kan upprepas.

En naturlig kemisk modifiering gav bättre effekt

Omodifierade suppressor-tRNA möter flera hinder. De måste vara tillräckligt stabila, laddas med rätt aminosyra, effektivt läsa förbi stoppkodonet och samtidigt undvika en alltför kraftig aktivering av det medfödda immunförsvaret.

Forskarna lade därför till en platsspecifik kemisk modifiering som förekommer naturligt i tRNA. Enligt rapporten förbättrade modifieringen tRNA-molekylernas laddning med aminosyror, ökade genomläsningen av för tidiga stoppkodon, förlängde den funktionella aktiviteten och minskade aktiveringen av det medfödda immunförsvaret. Det tillgängliga underlaget anger inte modifieringens namn, så den bör inte utan stöd beskrivas som exempelvis pseudouridin. 158

Poängen var att angripa flera flaskhalsar samtidigt. Ett tRNA som kan läsa förbi ett stoppkodon men snabbt bryts ned, laddas dåligt eller utlöser en stark immunreaktion skulle ha begränsat terapeutiskt värde.

Lungorna fick en skräddarsydd leveranslösning

Forskarna utvecklade också lipidnanopartiklar, LNP, som var anpassade till tRNA-molekylens speciella struktur. Olika formuleringar testades för att hitta en effektiv leverans, varefter de utvalda partiklarna gavs genom inhalation. Målet var att koncentrera RNA:t till lungvävnad och luftvägarnas celler. 18

Det är en icke-viral leveransmetod: lipidnanopartiklarna transporterar det terapeutiska RNA:t in i cellerna, men använder varken en virusvektor eller en permanent insättning av en korrigerad gen. Tidigare forskning hade redan visat att LNP-levererat sup-tRNA kunde återställa produktionen av fungerande protein i musmodeller. Det arbetet utgjorde en grund för den nya, tRNA-anpassade och lunginriktade lösningen. 4

Vad testerna visade

Kombinationen av sup-tRNA och inhalerade LNP återställde CFTR-produktion och tillhörande kanalaktivitet i flera experimentella modeller:

• Mänskliga bronkiala epitelceller: Behandlingen fick cellerna att läsa förbi det för tidiga stoppkodonet och åter börja producera fullängds-CFTR.
• Musmodeller av cystisk fibros: Inhalationen nådde lungorna och gav långvarig aktivitet, i rapporten upp till omkring 40 dagar hos möss. Det är ett prekliniskt resultat och kan inte antas gälla människor. 16
• Patientbaserade organoider: Metoden återställde fullängds-CFTR i en organoid med fyra CFTR-varianter, däribland två nonsensvarianter. 18

Organoidförsöket visade samtidigt en viktig begränsning. Det nybildade CFTR-proteinet behövde fortfarande kombinationen elexakaftor–tezakaftor–ivakaftor, ofta kallad Trikafta, för optimal veckning, transport till rätt plats i cellen och kanalaktivitet. Den möjliga behandlingslogiken är därför i åtminstone vissa mutationer: återställ först proteinproduktionen och förbättra sedan det räddade proteinets funktion. Metoden behöver alltså inte ersätta CFTR-modulatorer. 13

En plattform som kan nå fler sjukdomar

I princip kan suppressor-tRNA konstrueras för att känna igen var och en av de tre stoppkodonerna. Det gör strategin till en möjlig plattform för flera sjukdomar som orsakas av nonsensmutationer – om forskarna kan välja rätt tRNA, sätta in en lämplig aminosyra, leverera tillräckligt mycket RNA till rätt vävnad och samtidigt bevara normal proteinsyntes.

Möjligheten är bred, men inte automatisk. Olika proteiner kan tåla olika aminosyrabyten, och ett protein som räddats från ett för tidigt stopp kan fortfarande bli felveckat eller behöva ett stabiliserande läkemedel. Leveransen är dessutom org specific. En nanopartikel som optimerats för inhalation till lungorna behöver inte fungera lika bra i lever, muskler, hjärna eller njurar. Där krävs sannolikt andra formuleringar och andra sätt att administrera behandlingen. 34

Säkerhetsfrågorna är ännu olösta

Innan metoden kan närma sig klinisk användning behöver forskarna bland annat ta reda på:

• om sup-tRNA kan orsaka oönskad genomläsning av normala stoppkodon,
• om förändrad proteinsyntes kan leda till skadliga bieffekter eller felaktiga aminosyror,
• om upprepade inhalationer är säkra och effektiva,
• hur jämnt behandlingen sprids i lungorna och hur länge den förblir aktiv,
• om RNA:t eller lipidnanopartiklarna kan utlösa inflammation eller andra immunreaktioner.

Extern rapportering har bland annat lyft dosberoende inflammation i möss och de bredare andningsrelaterade säkerhetsfrågorna kring inhalerade LNP-system. Dessa risker måste undersökas noggrant innan behandlingen kan betraktas som kliniskt etablerad. 613

Studiens viktigaste framsteg är kombinationen av tRNA-kemi och organinriktad leverans. Genom att förbättra genomläsning, varaktighet, laddning med aminosyror och tolerabilitet – samtidigt som RNA:t styrdes till lungorna – kunde forskarna återställa meningsfull CFTR-produktion och funktion i prekliniska modeller och patientbaserade organoider.

Nästa steg är att se om effekten kan upprepas säkert och förutsägbart hos människor. Det återstår också att avgöra vilka CFTR-mutationer som kan behandlas med sup-tRNA ensamt och vilka som behöver kombineras med Trikafta eller andra läkemedel som hjälper det återställda proteinet att fungera.