Стартовые концентрации ключевых компонентов среды для высокоплотностной ферментации E. coli: обзор литературы

Введение

Не существует единой «лучшей» стартовой концентрации сульфата магния, сульфата аммония, хлорида аммония и витаминов для высокоплотностной ферментации E. coli, которая была бы универсальной. Анализ литературы позволяет выделить рабочие диапазоны, характерные для стандартных определённых (defined) и полуопределённых (semi-defined) сред, используемых в таких процессах.

Ключевой вывод: в основной среде (main culture medium) в качестве единственного неорганического источника азота используют либо сульфат аммония, либо хлорид аммония. Совместное присутствие обоих соединений в стандартных рецептурах встречается редко. Если же pH контролируется гидроксидом аммония (NH₄OH), основная часть азота может поступать именно с подтитровкой, а не из стартовой среды [1, 3].

Таблица рабочих концентраций

Компонент	Литературный источник / Среда	Рабочая концентрация в среде, г/л	Приблизительно, мМ	Примечания
MgSO₄	Минимальные среды M9/M63; типичная добавка 1 мМ MgSO₄	~0,12 г/л (безводный); ~0,25 г/л (MgSO₄·7H₂O)	~1 мМ	Стартовая концентрация ~1 мМ является наиболее распространённой [3, 9]
MgSO₄	Полуопределённая среда для высокоплотностной культуры E. coli DH5α	0,24 г/л	~0,97 мМ (для гептагидрата); ~2,0 мМ (для безводного)	Молярность зависит от формы соли; в источнике не указана гидратация
(NH₄)₂SO₄	Минимальная среда M63	2,0 г/л (1× M63: 10 г/л в 5× маточном растворе)	~15,1 мМ (NH₄)₂SO₄; ~30,3 мМ NH₄⁺	Типичный пример использования сульфата аммония
NH₄Cl	Минимальная среда M9	1,0 г/л (1× M9: 5 г/л в 5× маточном растворе)	~18,7 мМ NH₄Cl	Типичный пример использования хлорида аммония
NH₄Cl	Полуопределённая среда для высокоплотностной культуры E. coli	1,5 г/л	~28,0 мМ	Среда дополнительно содержит глюкозу, фосфатный буфер, NaCl, MgSO₄ и дрожжевой экстракт
Витамины: тиамина гидрохлорид	Примечание к fed-batch ферментации E. coli: маточный раствор 5 г/л	Недостаточно данных	Недостаточно данных	Финальная рабочая концентрация в среде не указана
Витамины: дрожжевой экстракт	Полуопределённая среда для высокоплотностной культуры	12 г/л	Не применимо	Дрожжевой экстракт — комплексный источник; пересчёт на мМ для отдельного витамина невозможен

Обсуждение: выбор источника азота

• Сульфат аммония ((NH₄)₂SO₄) используется в среде M63, а хлорид аммония (NH₄Cl) — в среде M9. Эти среды являются классическими примерами взаимозаменяемых рецептур; они не предусматривают одновременного внесения (NH₄)₂SO₄ и NH₄Cl в качестве стандартной комбинации .
• Для высокоплотностной ферментации по технологии fed-batch стартовая концентрация азота в batch-среде не обязательно должна быть высокой. Основная стратегия получения высокой плотности клеток заключается в контролируемой подаче углеродного субстрата (глюкозы) и, часто, азота (например, в виде NH₄OH для поддержания pH). В этом случае стартовая среда служит лишь для начального роста биомассы .

Практические рекомендации для стартовой среды

• MgSO₄: ~1–2 мМ (0,12–0,25 г/л).
• NH₄Cl: ~19–28 мМ (1,0–1,5 г/л) ИЛИ (NH₄)₂SO₄: ~15 мМ (2,0 г/л) — выбрать один.
• Витамины:
  • Для определённой среды (defined medium) по литературным данным можно рекомендовать провести собственный дизайн эксперимента (DOE) для подбора оптимальной концентрации тиамина, так как надёжных опубликованных рабочих концентраций недостаточно .
  • Для полуопределённой среды в качестве источника витаминов и факторов роста можно использовать дрожжевой экстракт в концентрации 5–12 г/л [3, 9].