Инженерная тРНК помогает обходить «стоп-сигналы» при муковисцидозе

Исследовательская группа под руководством специалистов Университета Торонто разработала неviral-ную РНК-стратегию для муковисцидоза, вызванного нонсенс-мутациями — генетическими ошибками, которые вставляют преждевременный сигнал остановки в инструкцию по сборке белка. Вместо редактирования гена CFTR учёные доставили в клетки сконструированную супрессорную транспортную РНК (sup-тРНК). Она распознаёт ошибочный стоп-сигнал и позволяет клетке продолжить сборку полноценного белка CFTR. 1

Результаты получили в клетках бронхиального эпителия, на моделях муковисцидоза у мышей и в органоидах, выращенных из клеток пациентов. Это многообещающая доклиническая платформа, но ещё не доказанное лечение для людей.

Когда генетическая инструкция обрывается слишком рано

Нонсенс-мутация заставляет клеточный аппарат синтеза белка остановить трансляцию раньше времени. В случае CFTR это может приводить к тому, что клетка производит мало полноценного белка или не производит его вовсе. Без него нарушается работа хлоридного канала, который необходим для нормального состояния дыхательных путей.

Это важное ограничение для существующих лекарств от муковисцидоза. Модуляторы CFTR улучшают сворачивание, транспорт к клеточной мембране или активность уже произведённого белка. Но они не могут полностью компенсировать ситуацию, когда преждевременный стоп-сигнал не позволяет собрать достаточное количество полноценного CFTR. Поэтому новая стратегия ориентирована на подгруппу пациентов с нонсенс-мутациями, которым одних модуляторов может быть недостаточно. 12

По оценкам, на нонсенс-мутации приходится около 11% наследственных генетических заболеваний. Поскольку один и тот же тип ошибки встречается в разных генах, безопасная технология «дочитывания» потенциально может применяться не только при муковисцидозе. 2

Как супрессорная тРНК обходит мутацию

В норме транспортная РНК сопоставляет кодоны матричной РНК с аминокислотами во время сборки белка. Исследователи изменили тРНК так, чтобы её антикодон распознавал преждевременный стоп-кодон в мутантной матричной РНК CFTR.

Достигнув ошибочного сигнала, супрессорная тРНК вставляет аминокислоту вместо остановки трансляции. Рибосома продолжает считывать инструкцию и создаёт полноразмерный белок CFTR. Иными словами, подход не исправляет последовательность ДНК, а временно обходит ошибочно установленный «знак остановки». 14

Поскольку РНК не предназначена для постоянного изменения генома, действие метода является временным. Если технология дойдёт до клинического применения, вероятно, потребуются повторные введения. Их частота будет зависеть от продолжительности эффекта и безопасности повторного дозирования.

Зачем тРНК подвергли химической модификации

У немодифицированных супрессорных тРНК есть несколько препятствий: они должны сохраняться в клетке достаточно долго, правильно заряжаться нужной аминокислотой, эффективно обходить стоп-кодон и не вызывать чрезмерную активацию врождённого иммунитета.

Команда внесла в тРНК точечную химическую модификацию, которая естественным образом встречается в тРНК. По данным исследования, она улучшила присоединение аминокислоты к тРНК, повысила эффективность «дочитывания» преждевременного стоп-кодона, продлила функциональную активность молекулы и снизила активацию врождённого иммунного ответа. В доступных материалах точное название модификации не указано, поэтому её не следует без доказательств называть, например, псевдоуридином. 158

Таким образом, учёные одновременно устранили несколько узких мест. ТРНК, которая умеет обходить стоп-кодон, но быстро разрушается, плохо связывает аминокислоту или сильно раздражает иммунную систему, имела бы ограниченную терапевтическую ценность.

Почему препарат решили доставлять в лёгкие

Исследователи также разработали липидные наночастицы с учётом необычной структуры тРНК-груза. Они протестировали разные составы по эффективности доставки, а выбранную формулу вводили ингаляционно — чтобы направить РНК в лёгочную ткань и клетки дыхательных путей. 18

Это неviral-ная система доставки: липидные наночастицы переносят терапевтическую РНК внутрь клеток, но не используют вирусный вектор и не встраивают исправленный ген в геном. Более ранние эксперименты уже показывали, что супрессорные тРНК, доставленные с помощью LNP, могут восстанавливать производство функциональных белков у мышей. Эта работа стала основой для создания наночастиц, специально адаптированных к тРНК и ингаляционному введению. 4

Что показали клетки, мыши и органоиды

Комбинация супрессорной тРНК с ингаляционными LNP восстановила производство CFTR и связанную с ним работу хлоридного канала в нескольких экспериментальных системах:

• Клетки бронхиального эпителия человека. Лечение помогло дочитать матричную РНК после преждевременного стоп-кодона и восстановить производство полноразмерного CFTR.
• Модели муковисцидоза у мышей. Ингаляционная доставка достигала лёгких, а активность сохранялась продолжительное время — по данным авторов, до примерно 40 дней. Это доклинический результат, который нельзя автоматически переносить на людей. 16
• Органоиды, полученные от пациентов. В модели с четырьмя вариантами CFTR, включая две нонсенс-мутации, подход восстановил производство полноразмерного белка. 18

Одновременно органоиды показали важное ограничение. В этой модели вновь произведённому CFTR всё ещё требовалась комбинация корректоров и потенциаторов элексакфатор–тезакафтор–ивакафтор, известная как Trikafta, чтобы белок оптимально свернулся, достиг клеточной мембраны и работал как канал. Следовательно, по крайней мере для некоторых мутаций логика лечения может выглядеть так: сначала восстановить производство белка, затем улучшить работу спасённого белка. Новая технология не обязательно заменит модуляторы CFTR. 13

Потенциал за пределами муковисцидоза

Теоретически супрессорные тРНК можно проектировать для распознавания каждого из трёх стоп-кодонов. Это создаёт платформу для целого класса мутаций: один общий принцип можно адаптировать к разным заболеваниям, если удастся подобрать подходящую тРНК, вставить правильную аминокислоту, доставить достаточное количество молекул в нужную ткань и сохранить нормальную трансляцию.

Однако широкое применение не гарантировано. Разные белки могут по-разному переносить замены аминокислот, а спасённый после преждевременной остановки белок всё равно может неправильно сворачиваться или нуждаться в стабилизирующем препарате. Кроме того, доставка зависит от органа. Формула, оптимизированная для ингаляционного введения в лёгкие, не обязательно подойдёт для печени, мышц, мозга или почек. Для каждой ткани могут потребоваться отдельные наночастицы и способ введения. 34

Какие вопросы безопасности ещё предстоит решить

Перед переходом от моделей к лечению необходимо выяснить:

• не вызовет ли супрессорная тРНК нежелательное «дочитывание» нормальных стоп-кодонов;
• не приведёт ли изменение трансляции к появлению вредных побочных белков или неправильных замен аминокислот;
• насколько безопасны и эффективны повторные ингаляции;
• насколько равномерно препарат распределяется в лёгких и как долго сохраняет активность;
• могут ли липидные наночастицы или сама РНК вызывать воспаление и другие иммунные реакции.

Внешние публикации указывали на дозозависимое воспаление у мышей и более общие вопросы безопасности ингаляционных LNP-систем для дыхательных путей. Эти риски необходимо тщательно изучить, прежде чем считать подход клинически подтверждённым. 613

Главное достижение работы — сочетание химической оптимизации тРНК с доставкой, ориентированной на конкретный орган. Повысив эффективность дочитывания, стабильность, загрузку аминокислотой и переносимость молекулы, а затем направив её в лёгкие, исследователи восстановили производство и значимую функцию CFTR в доклинических и пациентских моделях.

Следующий шаг — понять, удастся ли воспроизвести этот эффект у людей безопасно, предсказуемо и при повторном введении, а также потребуют ли разные мутации CFTR комбинированной терапии, чтобы восстановленный белок действительно работал.