WHOLISTIC: naukowcy obserwują komunikację komórek w całym żywym organizmie ryby

Fizjologia nie działa w izolowanych „szufladkach”: aktywność układu nerwowego, krążenie, trawienie i reakcje czuciowe mogą zmieniać się równocześnie. Dotychczasowe metody obrazowania żywych organizmów zwykle pozwalały jednak obserwować pojedynczą tkankę albo narząd. WHOLISTIC ma wypełnić tę lukę w badaniach przezroczystych, młodych osobników danio pręgowanego (Danio rerio).

Skrót WHOLISTIC oznacza WHole Organism Live Imaging System for recording Tissue and IntraCellular activity. System łączy szybkie obrazowanie fluorescencyjne 3D, genetycznie kodowane czujniki wapnia i analizę obliczeniową. Dzięki temu rejestruje zmienną w czasie aktywność komórek w całym ciele zwierzęcia, w skali sekund. 2

Jak działa WHOLISTIC

Larwy danio pręgowanego są przezroczyste, co umożliwia optyczny wgląd w ich narządy wewnętrzne. Badane zwierzęta wytwarzają czujniki wapniowe w szerokim zakresie komórek; zmiany fluorescencji stanowią odczyt dynamiki wewnątrzkomórkowego wapnia.

To ważne rozróżnienie: aktywność wapniowa jest użytecznym wskaźnikiem zmian stanu komórki, ale nie mierzy bezpośrednio połączeń synaptycznych ani sama w sobie nie dowodzi, że jedna komórka wywołała reakcję innej. 2

Na metodę składają się trzy elementy:

• Objętościowa mikroskopia fluorescencyjna wielokrotnie rejestruje trójwymiarowy obraz zwierzęcia, a nie tylko pojedynczą płaszczyznę. 2
• Wszechkomórkowe znakowanie czujnikami wapnia pozwala obserwować aktywność w różnych typach komórek i układach narządów, nie wyłącznie w neuronach. 2
• Przetwarzanie obliczeniowe i uczenie maszynowe pomagają wykrywać struktury komórkowe wykazujące aktywność oraz porządkować ogromne zbiory nagrań w interpretowalne wzorce. 2

Najistotniejsza zmiana jest więc nie tylko techniczna, ale też poznawcza: reakcje całego organizmu można oglądać jako skoordynowany układ. Potencjalne związki między narządami stają się widoczne w tym samym eksperymencie. 2

Co ujawniło obrazowanie całego ciała

Niedotlenienie i przekierowanie przepływu krwi

W warunkach niskiej dostępności tlenu WHOLISTIC pokazał skoordynowaną aktywność związaną ze zmianami krążenia, w tym z przekierowaniem przepływu krwi. Galeria projektu Janelia przedstawia spadek przepływu w okolicy krezkowej podczas hipoksji, przy jednoczesnym zwiększeniu przepływu w kierunku mózgu i serca. 8

Takie obserwacje pozwalają powiązać odpowiedzi układu nerwowego i układu krążenia w jednym przygotowaniu badawczym. Wskazują, że reakcja obejmująca cały organizm może priorytetowo traktować dostarczanie tlenu do najważniejszych narządów. Dokładny łańcuch przyczynowy wymaga jednak dalszych, celowanych eksperymentów. 28

Rdzeń kręgowy i komórki ependymalne

Platforma wykryła także skoordynowaną dynamikę w rdzeniu kręgowym oraz w komórkach ependymalnych, wyściełających układ komorowy. To sygnał, że mapy aktywności mogą obejmować zjawiska wykraczające poza tradycyjne, skupione na neuronach opisy układu nerwowego. 2

Obserwacja ma charakter hipotezotwórczy. Aktywność komórek ependymalnych związana z określonym stanem organizmu może mieć znaczenie dla fizjologii towarzyszącej snu, lecz sama korelacja sygnałów wapniowych nie dowodzi ich funkcji w śnie. WHOLISTIC umożliwia wskazanie takich kandydatów, a następnie ich sprawdzenie w bardziej selektywnych eksperymentach. 2

Ketamina po obu stronach granicy tkanek

Działanie leków może obejmować różne typy komórek i przedziały anatomiczne. Za pomocą WHOLISTIC badacze analizowali ostrą ekspozycję na ketaminę i zaobserwowali efekty dotyczące zarówno tkanki nerwowej, jak i opon mózgowo-rdzeniowych. 2

To praktyczna zaleta metody: obserwacja ograniczona do neuronów mogłaby pominąć odpowiedzi sąsiednich tkanek nienerwowych. Obrazowanie całego organizmu pozwala uchwycić takie efekty na granicach tkanek w ramach jednego doświadczenia. 2

Komórki związane z chrząstką reagujące na chłód

W doświadczeniach z ochładzaniem wykryto również odpowiedzi wapniowe w komórkach związanych z chrząstką. Wynik sugeruje, że aktywność związana z temperaturą nie musi ograniczać się do układu nerwowego, i pokazuje, jak szerokie obrazowanie komórkowe może ujawniać nieoczekiwane, potencjalne role czuciowe tkanek nieneuronalnych. 2

Dlaczego to ważne

WHOLISTIC rozwija ideę obrazowania całego mózgu danio pręgowanego, rozszerzając ją na resztę ciała. Już w 2013 r. obrazowanie całego mózgu tego przezroczystego kręgowca umożliwiło równoczesny zapis aktywności neuronalnej w całym mózgu. Nowe podejście obejmuje jednocześnie wiele układów narządów i typów komórek. 52

Ma to znaczenie dla pytań, w których biologia przekracza granice pojedynczego układu: jak mózg koordynuje krążenie pod wpływem stresu, jak leki oddziałują na tkanki nerwowe i nienerwowe albo jak sygnały czuciowe są reprezentowane poza klasycznymi drogami neuronalnymi. Metoda nie tworzy kompletnej mapy przyczynowo-skutkowej, lecz dostarcza ogólnoustrojowej mapy aktywności, wskazującej zależności warte dalszego sprawdzenia. 2

Kierunek otwarty na dalszy rozwój

Janelia przedstawia WHOLISTIC jako zasób oparty na zaawansowanej mikroskopii i analizie obliczeniowej. Strona projektu zawiera m.in. wizualizacje zmian krążenia związanych z niedotlenieniem. 28

Podejście może mieć zastosowanie także poza larwami danio pręgowanego. Obiecującym organizmem modelowym jest Danionella — bardzo mała ryba, u której nawet dorosłe osobniki pozwalają na rejestrowanie aktywności całego mózgu, co otwiera drogę do badań bogatszych repertuarów zachowań. Osobno Janelia informuje, że jej metoda mikroskopii ekspansyjnej całego ciała działa również na dojrzałych próbkach Danionella. 114

Kluczowe zastrzeżenie pozostaje niezmienne: obrazowanie wapniowe pokazuje skorelowaną dynamikę komórek. Nie ustala samo przez się bezpośredniej łączności, pełnego mechanizmu molekularnego ani związku przyczynowego. Siła WHOLISTIC polega na tym, że umożliwia obserwowanie i formułowanie hipotez o relacjach między narządami w skali, która wcześniej była trudna do osiągnięcia u żywego kręgowca. 2