AGENTEX pozwala testować nowe kody genetyczne w probówce

AGENTEX, czyli Automated Genetic tRNA Expansion, zmienia kolejność prac nad inżynierią kodu genetycznego. Zamiast najpierw przepisywać genom organizmu, a dopiero potem sprawdzać, czy nowy system translacji działa, naukowcy mogą złożyć jego warianty poza komórką, przetestować je robotycznie i wybrać najlepsze projekty do dalszych badań biologicznych. 6

Według przedstawionych wyników takie przeprojektowane systemy mogą wykorzystywać nawet 34 rodzaje aminokwasów, a nie 20 stosowanych przez standardowy kod biologiczny. 7 Nie chodzi przy tym o stworzenie większej liczby niż 64 kodonów. Chodzi o to, by większa część istniejących kodonów mogła otrzymać nowe, użyteczne znaczenia.

Problem, który AGENTEX omija

Standardowy kod genetyczny przypisuje 64 możliwe kodony — trójki nukleotydów — do 20 aminokwasów oraz sygnałów start i stop. Ponieważ wiele kodonów oznacza ten sam aminokwas, w tym systemie istnieje pewna nadmiarowość, którą można próbować wykorzystać do zmiany przypisań.

W żywej komórce taka operacja jest jednak ryzykowna. Ten sam kodon może występować w wielu genach, w tym w genach niezbędnych do przeżycia. Jeśli nagle zacznie oznaczać inny aminokwas, wiele naturalnych białek może zostać zbudowanych błędnie. Dlatego komórkowa ekspansja kodu często wymaga usunięcia lub zastąpienia wszystkich odpowiednich kodonów w genomie, a także ograniczenia konkurencji ze strony rodzimego aparatu translacyjnego.

AGENTEX przenosi pierwszy eksperyment do układu bezkomórkowego. Naukowcy dostarczają własny zestaw składników translacji i sprawdzają, czy wybrana mapa „kodon–aminokwas” prowadzi do powstania właściwego białka lub peptydu — zanim podejmą się modyfikacji całego genomu. 615

Jak działają przeprojektowane kody

Odczyt kodonu zależy od współpracy informacyjnego RNA, transferowego RNA oraz aparatu translacyjnego. AGENTEX koncentruje się na przebudowie tych relacji molekularnych, zamiast traktować naturalny kod jako niezmienną regułę.

W ramach platformy badano między innymi przeprojektowane rybosomy, tRNA oraz syntetazy aminoacylo-tRNA (aaRS) — enzymy, które „ładują” właściwe aminokwasy na odpowiednie tRNA. Celem było uzyskanie wzajemnego rozpoznawania tych elementów oraz ich możliwie dużej niezależności od standardowego systemu translacji. Naukowcy zastosowali też zautomatyzowane metody przeszukiwania bibliotek syntetycznych tRNA pod kątem ich aminoacylacji. 6

Dzięki temu wybrane kodony można przypisywać innym aminokwasom, w tym aminokwasom niestandardowym, w specjalnie odtworzonej reakcji bez udziału komórki. Wcześniejsze systemy z wykorzystaniem tRNA przepisywanych in vitro pokazały już, że translacja może działać według uproszczonych lub zamienionych zasad. AGENTEX rozwija tę ideę w kierunku zautomatyzowanego, równoległego prototypowania wielu kodów. 5

Przedstawione dane opisują dwa przeprojektowane kody testowane obok kodu standardowego, z ponownym przypisaniem do trzech kodonów i włączaniem aminokwasów niestandardowych. 8 Ponieważ każdy wariant korzysta z własnego, kompatybilnego zestawu składników translacji, różne projekty można porównywać w jednym schemacie eksperymentalnym, bez narzucania jednej zmienionej interpretacji żywemu genomowi.

Dlaczego automatyzacja ma znaczenie

Kod genetyczny nie jest tylko tabelą. Aby nowe przypisanie zadziałało, odpowiednie tRNA musi rozpoznać właściwy kodon, syntetaza musi przyłączyć do niego właściwy aminokwas, a rybosom musi zaakceptować powstały kompleks z odpowiednią dokładnością i wydajnością. W układzie bezkomórkowym poszczególne składniki można dodawać, usuwać i wymieniać niezależnie. 1516

AGENTEX wykorzystuje tę kontrolę w cyklu „zaprojektuj–zbuduj–przetestuj”:

1. Zaprojektować proponowaną tabelę kodonów i zestaw składników potrzebnych do jej wdrożenia.
2. Zbudować kombinacje tRNA, syntetaz i rybosomów w reakcji bezkomórkowej.
3. Przetestować aminoacylację, translację oraz włączanie wybranych aminokwasów.
4. Porównać wydajność, dokładność i niezależność wielu kandydatów.
5. Przekazać dalej tylko najbardziej obiecujące warianty do trudniejszych badań w komórkach.

Praktyczna korzyść jest prosta: nieudany projekt można odrzucić na etapie reakcji, zamiast budować pod jego kątem cały zmodyfikowany organizm. Udany wariant można natomiast dopracować przed rozpoczęciem edycji genomu, tworzenia szczepu i walidacji biologicznej. 6

Czego AGENTEX jeszcze nie rozwiązuje

AGENTEX pokazuje działanie przeprojektowanego systemu translacji in vitro. Sam w sobie nie tworzy organizmu, który potrafi utrzymać, kopiować i regulować tak zmieniony kod, a następnie rozmnażać się z jego użyciem.

Wprowadzenie podobnego systemu do żywej komórki nadal wymagałoby między innymi:

• Zgodności z całym genomem: ponownie przypisane kodony mogłyby wymagać usunięcia lub zastąpienia, aby naturalne białka nie były błędnie tłumaczone.
• Kontroli nad składnikami: przeprojektowane tRNA, syntetazy i ewentualnie rybosomy musiałyby działać niezawodnie obok rodzimego aparatu translacyjnego albo zamiast niego.
• Dostępności aminokwasów: komórka musiałaby je pobierać lub syntezować i kierować do właściwej ścieżki translacji.
• Selektywnego ładowania tRNA: syntetazy musiałyby przyłączać właściwy aminokwas do właściwego tRNA, unikając niepożądanych reakcji krzyżowych. 5
• Odpowiedniej wydajności: zmodyfikowany system musiałby zapewniać wystarczającą produkcję białek, dokładność, wzrost komórki i stabilne dziedziczenie zmian.

Skalę trudności pokazują wcześniejsze badania komórkowe. W jednym z najnowszych systemów ssaczych udało się włączyć do pojedynczego białka nawet pięć różnych syntetycznych aminokwasów, wykorzystując rzadkie kodony. 4 To znaczący wynik, ale nie jest równoznaczny ze stworzeniem stabilnego, samoreplikującego się organizmu korzystającego z pełnego projektu AGENTEX obejmującego 34 aminokwasy. Dostarczone materiały nie potwierdzają, że taki organizm już zbudowano.

Co ta technologia może umożliwić

Większy alfabet chemiczny białek

Naturalne białka powstają z relatywnie niewielkiego zestawu budulców. Szersze alfabety kodu mogłyby pozwolić badać białka i biopolimery peptydowe zawierające grupy chemiczne, łańcuchy boczne lub elementy szkieletu niedostępne w zwykłej translacji. Raport dotyczący AGENTEX bezpośrednio łączy platformę z syntezą biopolimerów peptydowych i projektowaniem kodów genetycznych na żądanie. 6

Nowe cząsteczki dla farmacji

Aminokwasy niestandardowe mogą nadawać białkom właściwości przydatne w procesie odkrywania leków — na przykład zmienioną reaktywność, większą stabilność albo możliwość kontrolowanego łączenia z innymi cząsteczkami. AGENTEX może ułatwić wczesne przesiewanie wielu projektów molekularnych. To jednak przewaga na etapie odkrywania i inżynierii, a nie dowód, że powstał już konkretny lek. Każde zastosowanie terapeutyczne wymagałoby standardowych badań skuteczności, bezpieczeństwa, dostarczania i produkcji.

Projektowane materiały

Synteza rybosomalna zapewnia kontrolę nad sekwencją. Połączenie jej z większym zestawem chemicznych cegiełek może umożliwić tworzenie biomateriałów o nowych właściwościach wiążących, katalitycznych, optycznych, mechanicznych lub związanych z samorzutnym składaniem. Układy bezkomórkowe wykorzystywano już do produkcji aktywnych białek według przeprojektowanych zasad kodu, co stanowi podstawę dla takich eksperymentów. 5

Możliwa droga do izolacji genetycznej

Znacznie odmienny kod genetyczny mógłby w przyszłości utrudniać organizmom zmodyfikowanym wymianę funkcjonalnej informacji genetycznej z organizmami naturalnymi, a także ograniczać możliwość wykorzystywania ich przez typowe pasożyty biologiczne. AGENTEX nie demonstruje jeszcze takiego efektu. Jego bezpośredni wkład polega na umożliwieniu porównywania kandydackich, ortogonalnych kodów przed podjęciem znacznie trudniejszej próby zainstalowania jednego z nich w żywym, rozmnażającym się systemie.

Czym AGENTEX różni się od wcześniejszych metod

Tradycyjna ekspansja kodu genetycznego często zaczyna się od przypisania jednego aminokwasu niestandardowego kodonowi stop albo od uwolnienia niewielkiej liczby kodonów poprzez szeroko zakrojone modyfikacje genomu. Inne badania doprowadziły do powstania szerszych konstrukcji, w tym systemu 68 kodonów zdolnego do włączania czterech różnych aminokwasów niekanonicznych do jednego białka. Badania bezkomórkowe pokazały także, że można tworzyć zamienione lub uproszczone kody z wykorzystaniem zmodyfikowanych albo przepisywanych in vitro tRNA. 35

Najbardziej charakterystycznym osiągnięciem AGENTEX jest więc nie tylko liczba aminokwasów, lecz także sposób pracy: zautomatyzowane, wielokrotne prototypowanie systemów translacji przed przystąpieniem do przeprogramowania komórki. Platforma tworzy warstwę testową między teoretycznym projektem kodu a żywym organizmem. Może ograniczyć marnowanie czasu, wcześniej ujawniać niezgodności i zwiększyć liczbę architektur kodu, które da się realnie sprawdzić.

Najważniejsze zastrzeżenie pozostaje jednak bez zmian: AGENTEX ułatwia prototypowanie alternatywnych kodów genetycznych, ale nie usuwa biologicznych i inżynieryjnych problemów związanych z ich działaniem wewnątrz żywych komórek.