Zmodyfikowane tRNA omija błędne sygnały stop i przywraca funkcję CFTR

Zespół kierowany przez badaczy z Uniwersytetu w Toronto opracował niegenową strategię RNA dla mukowiscydozy wywołanej mutacjami nonsensownymi. Są to błędy genetyczne, które wstawiają do instrukcji produkcji białka przedwczesny sygnał zakończenia. Zamiast edytować gen CFTR, naukowcy dostarczyli do komórek zaprojektowane supresorowe transferowe RNA (sup-tRNA). Cząsteczki te mają „odczytać” błędny sygnał stop i pozwolić komórce dokończyć produkcję pełnowymiarowego białka CFTR. 1

Efekt pokazano w komórkach nabłonka oskrzeli, modelach mysich oraz organoidach mukowiscydozy wyhodowanych z komórek pacjentów. To obiecujący wynik przedkliniczny, a nie potwierdzona terapia dla ludzi.

Problem: jeden błędny sygnał skraca białko CFTR

Mutacja nonsensowna sprawia, że aparat komórki odpowiedzialny za produkcję białek kończy odczytywanie instrukcji zbyt wcześnie. W przypadku CFTR może to oznaczać, że komórka wytwarza bardzo mało pełnowymiarowego białka albo nie wytwarza go wcale. Bez niego nie działa prawidłowo kanał chlorkowy potrzebny do utrzymania właściwego nawodnienia śluzu w drogach oddechowych.

To ważne ograniczenie obecnych leków na mukowiscydozę. Modulatory CFTR poprawiają fałdowanie, transport lub aktywność białka, które komórka już wyprodukowała. Nie mogą jednak w pełni pomóc, jeśli przedwczesny sygnał stop uniemożliwia powstanie wystarczającej ilości kompletnego CFTR. Dlatego badanie koncentruje się na podgrupie pacjentów z mutacjami nonsensownymi, którzy mogą nie odpowiadać odpowiednio na same modulatory. 12

Mutacje nonsensowne szacuje się na przyczynę około 11% dziedzicznych chorób genetycznych. Ponieważ ten sam rodzaj błędu w odczycie instrukcji występuje w wielu genach, bezpieczna metoda jego omijania mogłaby w przyszłości znaleźć zastosowanie także poza mukowiscydozą. 2

Jak sup-tRNA omija mutację

Transferowe RNA zwykle dopasowuje kodony informacyjnego RNA do odpowiednich aminokwasów podczas produkcji białka. Naukowcy zaprojektowali sup-tRNA tak, aby jego antykodon rozpoznawał przedwczesny kodon terminacyjny w zmutowanym informacyjnym RNA CFTR.

Gdy sup-tRNA dociera do błędnego sygnału stop, wstawia aminokwas zamiast kończyć odczyt. Rybosom może wtedy kontynuować pracę i wytworzyć pełnowymiarowe białko CFTR. To biologiczny „objazd” wokół błędu, a nie naprawa sekwencji DNA. 14

Ponieważ RNA nie ma trwale zmieniać genomu, działanie tej metody jest przejściowe. Gdyby terapia trafiła do badań klinicznych, prawdopodobnie wymagałaby powtarzania dawek. Częstotliwość podawania zależałaby od tego, jak długo utrzymuje się aktywność cząsteczki i jak bezpieczne okazuje się wielokrotne leczenie.

Dlaczego potrzebna była modyfikacja chemiczna

Niezmodyfikowane sup-tRNA napotyka kilka problemów: musi przetrwać w komórce dostatecznie długo, zostać załadowane właściwym aminokwasem, skutecznie odczytać przedwczesny kodon stop i nie wywołać nadmiernej reakcji wrodzonego układu odpornościowego.

Zespół wprowadził w określonym miejscu modyfikację chemiczną występującą naturalnie w tRNA. Według raportu poprawiła ona przyłączanie aminokwasu do tRNA, zwiększyła skuteczność odczytu przedwczesnego sygnału stop, wydłużyła aktywność funkcjonalną cząsteczki i ograniczyła aktywację wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Dostępne materiały nie podają nazwy tej modyfikacji, dlatego nie należy utożsamiać jej bez podstaw z konkretnym związkiem, takim jak pseudourydyna. 158

Modyfikacja usuwała więc kilka przeszkód jednocześnie. tRNA, które potrafi ominąć kodon stop, ale szybko się rozpada, słabo wiąże aminokwas lub silnie pobudza odporność, miałoby niewielką wartość terapeutyczną.

Nanocząsteczki zaprojektowane dla płuc

Badacze opracowali także formulacje nanocząsteczek lipidowych (LNP) dostosowane do nietypowej, rozbudowanej struktury tRNA. Przetestowali różne warianty pod kątem skuteczności dostarczania, a wybraną formulację podali wziewnie. Taka droga podania ma kierować RNA przede wszystkim do tkanki płucnej i komórek dróg oddechowych. 18

To system niegenowy i niewirusowy: nanocząsteczki lipidowe przenoszą terapeutyczne RNA do komórek, ale nie korzystają z wektora wirusowego ani nie wprowadzają na stałe skorygowanego genu. Wcześniejsze badania wykazały już, że sup-tRNA dostarczane za pomocą LNP mogą przywracać produkcję funkcjonalnych białek w modelach mysich, co stworzyło podstawę dla nowszego projektu dostosowanego do konkretnego ładunku i podania do płuc. 4

Co pokazały testy

Połączenie sup-tRNA z wziewnymi LNP przywróciło produkcję CFTR oraz powiązaną z nim aktywność kanału w kilku modelach:

• Ludzkie komórki nabłonka oskrzeli: terapia umożliwiła odczytanie przedwczesnego kodonu terminacyjnego i przywróciła produkcję pełnowymiarowego CFTR.
• Mysie modele mukowiscydozy: podanie wziewne dotarło do płuc i zapewniło przedłużoną aktywność, raportowaną u myszy na poziomie do około 40 dni. To wynik przedkliniczny, którego nie można automatycznie odnosić do ludzi. 16
• Organoidy pochodzące od pacjenta: metoda przywróciła pełnowymiarowe CFTR w organoidzie zawierającym cztery warianty genu, w tym dwa warianty nonsensowne. 18

Organoid ujawnił również istotne ograniczenie. W tym modelu nowo wytworzone CFTR nadal potrzebowało połączenia korektora i potencjatora — elexakaftoru, tezakaftoru i iwakaftoru, znanego jako Trikafta — aby osiągnąć optymalne fałdowanie, transport do błony komórkowej i aktywność kanału. Najbardziej prawdopodobny schemat leczenia w przypadku co najmniej części mutacji wygląda więc tak: najpierw przywrócić produkcję białka, a potem poprawić działanie uratowanego CFTR. Nowa metoda nie musi zatem całkowicie zastąpić modulatorów. 13

Potencjał wykraczający poza mukowiscydozę

Teoretycznie sup-tRNA można projektować tak, aby rozpoznawało każdy z trzech kodonów stop. Tworzy to platformę ukierunkowaną na klasę mutacji: ogólną strategię można byłoby dostosowywać do różnych chorób, wybierając właściwe tRNA, odpowiedni aminokwas i sposób dostarczenia do konkretnej tkanki.

Nie oznacza to jednak, że jedna formulacja zadziała w każdej chorobie. Różne białka mogą różnie tolerować podstawienie aminokwasu, a białko uratowane przed przedwczesnym zakończeniem może nadal źle się fałdować albo wymagać leku stabilizującego. Dostarczanie RNA jest również zależne od narządu. Nanocząsteczki zoptymalizowane do wziewnego podania do płuc nie muszą sprawdzić się w wątrobie, mięśniach, mózgu czy nerkach. Każdy z tych celów może wymagać innej nanocząsteczki i innej drogi podania. 34

Bezpieczeństwo pozostaje kluczową niewiadomą

Zanim wyniki z modeli będzie można przełożyć na leczenie, trzeba odpowiedzieć między innymi na pytania:

• Czy sup-tRNA może przypadkowo omijać prawidłowe sygnały stop?
• Czy zmieniony sposób translacji może prowadzić do powstawania szkodliwych białek lub niewłaściwych podstawień aminokwasów?
• Czy formulacja będzie bezpieczna i skuteczna po wielokrotnym podaniu wziewnym?
• Jak równomiernie rozprowadzi się w płucach i jak długo pozostanie aktywna?
• Czy LNP lub samo RNA wywołają stan zapalny albo inną reakcję immunologiczną?

W komentarzach zewnętrznych zwracano uwagę na zależny od dawki stan zapalny u myszy oraz szersze wyzwania związane z bezpieczeństwem wziewnych terapii wykorzystujących LNP. Kwestie te wymagają dokładnych badań, zanim metoda będzie mogła zostać uznana za ustalone leczenie kliniczne. 613

Najważniejszym osiągnięciem pracy jest połączenie chemii tRNA z dostarczaniem ukierunkowanym na konkretny narząd. Dzięki poprawie odczytu kodonu stop, trwałości, przyłączania aminokwasu i tolerancji oraz dzięki skierowaniu ładunku do płuc badacze przywrócili znaczącą produkcję i funkcję CFTR w modelach przedklinicznych i organoidach pochodzących od pacjentów. Następny etap to sprawdzenie, czy efekt można bezpiecznie, powtarzalnie i przewidywalnie odtworzyć u ludzi — oraz czy poszczególne mutacje CFTR będą wymagały terapii skojarzonej.