Toksisitet hos rekombinante proteiner er en viktig risikofaktor.
Toksisitet er et velkjent problem ved ekspresjon i E. coli, og har ført til utvikling av stammer som C41(DE3) og C43(DE3), som er bedre egnet for toksiske proteiner.P
I en metabolsk ingeniørmodell med BL21(DE3) forårsaket IPTG sammen med et toksisk substrat betydelig fysiologisk stress. Dette betyr ikke at «IPTG alltid er giftig», men det viser at induksjonsbetingelser kan forverre en allerede belastet cellestatus.P
Den mest presise konklusjonen på det opprinnelige spørsmålet er:
Hvis morceller etter over natten-induksjon fortsatt har et intakt, funksjonelt ekspresjonsplasmid med regulatoriske elementer, og en ny kultur får nok generasjoner til å gjenopprette sunn vekst, kan de i prinsippet induseres på nytt i hovedkulturens sluttfase.
Likevel øker denne fremgangsmåten risikoen for mislykket ekspresjon, lavere utbytte og batch-variasjon, spesielt ved høykopi-plasmider, sterke promotorer, toksiske proteiner, langvarig induksjon ved 37 °C eller høye IPTG-konsentrasjoner.NPPP
Mairhofer J, et al. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during recombinant protein production. Microbial Cell Factories. 2013. — Sammenligner vekst og plasmidtap hos flere verter etter induksjon.N
Tripathi NK, et al. Impact of the Expression System on Recombinant Protein Production in Escherichia coli. 2021. — Diskuterer metabolsk belastning fra transkripsjon/translokasjon og valg av ekspresjonssystem.P
Kopp J, et al. Optimizing recombinant protein expression via automated induction profiling in Escherichia coli. 2017. — Viser betydningen av IPTG-konsentrasjon, temperatur og metabolsk belastning for vekst og ekspresjon.P
van Loosdrecht MCM, et al. The Impact of IPTG Induction on Plasmid Stability and Heterologous Protein Production. 2020. — Undersøker direkte forholdet mellom IPTG-induksjon, celleoverlevelse/vekst og plasmidstabilitet.P
Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 1999; og senere oversiktsartikler. — Forklarer at høykopi-plasmider, toksiske eller vekstreduserende fremmede gener og høycelletetthetsdyrking øker risikoen for plasmidtap.S
Mairhofer J, et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3). Microbial Cell Factories. 2015. — Eksperimentelt eksempel på at IPTG forverrer eksisterende cellestress i et spesifikt system.P
Saida F. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 2004. — Oversikt over toksisitet hos rekombinante proteiner og egnede vertsstammer.P
For å avgjøre om din egen batch har «mistet induksjonsevnen», er det mest overbevisende ikke teoretiske slutninger, men å isolere enkeltkolonier fra den nye kulturen: bekreft antibiotikaresistens, utfør plasmidrestriksjonsanalyse/sekvensering, og sammenlign med en uindusert seed-kontroll ved samme OD og IPTG-betingelser ved hjelp av SDS-PAGE eller Western blot.