AGENTEX tester nye genetiske koder – uten å omskrive en eneste celle

AGENTEX står for «Automated Genetic tRNA Expansion» og endrer rekkefølgen på hvordan forskere vanligvis utvikler nye genetiske koder. I stedet for først å omskrive genomet til en organisme og deretter finne ut om den nye oversettelsesmaskinen fungerer, kan forskerne bygge kandidat-systemer utenfor cellen, teste dem robotisert og ta de beste designene videre til senere celleforsøk. 6

Det rapporterte arbeidet støtter systemer som kan bruke opptil 34 aminosyrebyggesteiner, mot 20 i den vanlige biologiske koden. 7 Poenget er ikke å skape mer enn 64 kodoner, men å gjøre flere av de eksisterende kodonene tilgjengelige for nye oppgaver.

Problemet AGENTEX forsøker å unngå

Den genetiske standardkoden kobler 64 mulige triplette-kodoner til aminosyrer samt start- og stoppsignaler. Flere kodoner er overflødige fordi de angir den samme aminosyren. Denne redundansen skaper muligheter for å gi enkelte kodoner nye betydninger.

I en levende celle kan en slik endring imidlertid få store konsekvenser. Det samme kodonet kan finnes i mange gener som er nødvendige for at cellen skal overleve. Hvis kodonet plutselig betyr en annen aminosyre, kan resultatet bli omfattende feil i proteinproduksjonen. Forskerne kan derfor måtte fjerne eller erstatte alle forekomster av kodonet i genomet, samtidig som cellens opprinnelige oversettelsesmaskineri må hindres i å konkurrere med det konstruerte systemet.

AGENTEX flytter det første forsøket ut av cellen. Forskerne kan sette sammen en tilpasset samling av oversettelseskomponenter og undersøke om en foreslått kodon-aminosyre-kartlegging lager riktig protein eller peptid – før de begynner på omfattende genomendringer. 615

Slik bygges de nye kodene

Et kodon tolkes gjennom samspillet mellom budbringer-RNA, transfer-RNA (tRNA) og resten av oversettelsesmaskineriet. AGENTEX forsøker å endre disse molekylære koblingene i stedet for å behandle den naturlige koden som uforanderlig.

Arbeidet undersøkte konstruerte ribosomer, tRNA-er og aminoacyl-tRNA-syntetaser – enzymer som kobler aminosyrer til riktige tRNA-er – for å finne komponenter som kjenner igjen hverandre, men som i minst mulig grad forstyrrer standardmaskineriet. Plattformen brukte også automatiserte metoder til å undersøke biblioteker av syntetiske tRNA-er og hvor effektivt de ble ladet med aminosyrer. 6

Dermed kan utvalgte kodoner kobles til andre aminosyrer, også ikke-standardiserte aminosyrer, i en kontrollert cellefri reaksjon. Tidligere rekonstruerte systemer hadde allerede vist at proteinsyntese kan fungere med forenklede eller ombyttede genetiske koder. Systemer basert på tRNA-er transkribert in vitro kunne blant annet lage aktive proteiner med en redesignet kode. 5 AGENTEX bygger videre på dette med en automatisert og parallell arbeidsflyt.

Det rapporterte arbeidet beskriver to redesignede genetiske koder som ble testet sammen med standardkoden. Kodene innebar omfordeling av opptil tre kodoner og inkorporering av ikke-standardiserte aminosyrer. 8 Siden hvert alternativt system er satt sammen av kompatible oversettelseskomponenter, kan flere kodeutforminger vurderes innenfor samme eksperimentelle rammeverk – uten å tvinge én ny tolkning inn i et levende genom.

Hvorfor robotisering er viktig

En genetisk kode er ikke bare en tabell. For at en ny kodon-tilordning skal fungere, må de aktuelle tRNA-ene gjenkjenne de riktige kodonene, syntetasene må koble riktig aminosyre til riktig tRNA, og ribosomet må ta imot disse kompleksene med tilstrekkelig presisjon og effektivitet. I cellefrie systemer kan forskerne legge til, fjerne eller bytte ut komponentene enkeltvis. 1516

AGENTEX legger til rette for en design–bygg–test-syklus:

1. Design: Lag en kandidatkode og bestem hvilke oversettelseskomponenter den krever.
2. Bygg: Sett sammen kombinasjoner av tRNA-er, syntetaser og ribosomer i en cellefri reaksjon.
3. Test: Mål lading av tRNA, proteinsyntese og innbygging av de valgte aminosyrene.
4. Sammenlign: Vurder utbytte, nøyaktighet og hvor godt systemene holder seg adskilt fra standardkoden.
5. Velg ut: Ta bare de mest lovende designene videre til mer krevende biologiske forsøk.

Den praktiske gevinsten er større tempo og flere forsøk. Et mislykket design kan kasseres som en reaksjon i et prøverør, i stedet for å ende som et mislykket prosjekt med genomredigering og konstruksjon av en hel organisme. Et vellykket design kan finjusteres før forskerne går videre til den langt vanskeligere valideringen i levende celler. 6

Dette har plattformen ikke løst

AGENTEX viser at redesignede oversettelsessystemer kan fungere in vitro. Plattformen skaper ikke i seg selv en levedyktig organisme som kan vedlikeholde, kopiere og regulere en omfattende omskrevet genetisk kode.

Overføring til levende celler vil fortsatt kreve flere krevende steg:

• Kompatibilitet i hele genomet: Kodoner som får ny betydning, kan måtte fjernes eller erstattes slik at cellens egne proteiner ikke blir feiltolket.
• Kontroll over komponentene: Konstruerte tRNA-er, syntetaser og eventuelt ribosomer må fungere stabilt sammen med – eller i stedet for – cellens naturlige maskineri.
• Tilgang på aminosyrer: Cellen må enten produsere eller ta opp hver ikke-standardisert aminosyre og levere den til riktig oversettelsesvei.
• Selektiv lading: Syntetasene må koble riktig aminosyre til riktig tRNA uten uønskede kryssreaksjoner. 5
• Ytelse over tid: Systemet må opprettholde tilstrekkelig proteinproduksjon, nøyaktighet, vekst og nedarving.

Tidligere celleforsøk viser hvor stor utfordringen er. Et nyere system i pattedyrceller rapporterte innbygging av opptil fem ulike syntetiske aminosyrer i ett enkelt protein ved å ta i bruk sjeldne kodoner. 4 Det er et viktig resultat i levende celler, men noe annet enn å vise en stabil, selvreproduserende organisme som bruker en AGENTEX-lignende kode med 34 aminosyrer. Det foreliggende materialet dokumenterer ikke at en slik organisme er bygget.

Hva teknologien kan føre til

Større kjemisk alfabet for proteiner

Naturlige proteiner bygges av et relativt begrenset utvalg aminosyrer. Mer fleksible genetiske koder kan gjøre det mulig å utforske proteiner og peptidbiopolymerer med kjemiske grupper, sidekjeder eller strukturer som vanlig proteinsyntese ikke kan lage. AGENTEX-arbeidet knytter plattformen direkte til syntese av peptidbiopolymerer og behovsstyrt utvikling av genetiske koder. 6

Nye kandidater i legemiddelutvikling

Ikke-standardiserte aminosyrer kan gi egenskaper som er interessante i tidlig legemiddelforskning, for eksempel endret reaktivitet, bedre stabilitet eller mulighet for mer kontrollert kobling til andre molekyler. AGENTEX kan gjøre det enklere å undersøke mange molekylære varianter på et tidlig stadium.

Det er likevel en utviklingsfordel – ikke dokumentasjon på at et bestemt AGENTEX-produkt allerede er et legemiddel. Eventuell medisinsk bruk må fortsatt gjennom vanlig testing av effekt, sikkerhet, levering og produksjon.

Programmerbare materialer

Ribosomer gir presis kontroll over rekkefølgen på byggesteinene. Kombinert med et større kjemisk utvalg kan dette åpne for biomaterialer med nye egenskaper knyttet til binding, katalyse, optikk, mekanikk eller selvorganisering. Cellefrie systemer har allerede vist at aktive proteiner kan produseres med redesignede kodeoppsett. 5

Mulig genetisk isolasjon

En tilstrekkelig annerledes genetisk kode kan på sikt gjøre det vanskeligere for konstruerte organismer å utveksle funksjonell genetisk informasjon med naturlige organismer, eller for vanlige biologiske parasitter å bruke dem. AGENTEX viser ikke at dette målet er nådd. Det umiddelbare bidraget er å la forskerne sammenligne kandidatkoder før de forsøker å installere én av dem i et levende og formerende system.

Sammenlignet med tidligere metoder

Tradisjonell utvidelse av den genetiske koden begynner ofte med å gi én ikke-standardisert aminosyre en stoppkodon-funksjon, eller med å frigjøre et lite antall kodoner gjennom omfattende genomredigering. Andre studier har demonstrert bredere løsninger, blant annet et system med 68 kodoner som kunne bygge inn fire ulike ikke-kanoniske aminosyrer i ett protein. Cellefrie forsøk har også laget ombyttede eller forenklede koder ved hjelp av konstruerte eller tRNA-er transkribert in vitro. 35

AGENTEX’ særpreg ligger derfor like mye i arbeidsflyten som i antallet aminosyrer: Plattformen automatiserer og parallelliserer utviklingen av oversettelsessystemer før en genetisk kode installeres i en celle. Den fungerer som et mellomledd mellom en teoretisk kode og en levende organisme.

Det kan redusere bortkastet arbeid, avdekke inkompatibilitet tidligere og gjøre det mulig å teste langt flere kodearkitekturer. Men den viktige begrensningen består: AGENTEX gjør alternative genetiske koder enklere å prototype – ikke de biologiske og tekniske problemene ved å få dem til å fungere inne i levende celler.