Konstruert tRNA kan omgå genetiske stoppfeil ved cystisk fibrose

Forskere ved University of Toronto har utviklet en ikke-viral RNA-metode for cystisk fibrose som skyldes nonsense-mutasjoner – genetiske feil som legger inn et for tidlig stoppsignal i oppskriften på et protein. I stedet for å redigere CFTR-genet tilførte forskerne et konstruert suppressor-transfer-RNA (sup-tRNA) som kan lese forbi det feilplasserte stoppsignalet. Dermed får cellene mulighet til å fullføre produksjonen av et fullengdes CFTR-protein. 1

Forsøket ble gjennomført i bronkialepitelceller, musemodeller og organoider dyrket fra pasientceller. Resultatene er lovende, men befinner seg fortsatt på et preklinisk stadium – dette er ikke en dokumentert behandling for mennesker.

Når et stoppsignal kutter CFTR-proteinet

En nonsense-mutasjon får cellens proteinsyntesemaskineri til å avslutte arbeidet for tidlig. I CFTR-genet kan dette føre til at cellene produserer lite eller ingen fullengdes protein som fungerer som en kloridkanal.

Det er en viktig forskjell sammenlignet med dagens CFTR-modulatorer. Slike legemidler er utviklet for å bedre foldingen, transporten eller aktiviteten til CFTR-proteinet som allerede er produsert. De kan ikke fullt ut kompensere når et for tidlig stoppsignal hindrer cellen i å lage nok komplett protein. Studien retter seg derfor mot en undergruppe med CFTR-nonsense-mutasjoner som ikke nødvendigvis får tilstrekkelig effekt av modulatorer alene. 12

Nonsense-mutasjoner anslås å stå bak rundt 11 prosent av arvelige genetiske sykdommer. Fordi samme type oversettelsesfeil opptrer i mange ulike gener, kan en trygg metode for å lese forbi stoppsignaler i prinsippet tilpasses flere sykdommer enn cystisk fibrose. 2

Slik fungerer suppressor-tRNA

Transfer-RNA, eller tRNA, kobler vanligvis kodoner i budbringer-RNA til riktige aminosyrer mens ribosomet bygger et protein. Forskerne konstruerte tRNA-molekyler med antikodoner som gjenkjenner et for tidlig stoppsignal i mutert CFTR-budbringer-RNA.

Når sup-tRNA-et kommer frem til det feilaktige stoppsignalet, setter det inn en aminosyre i stedet for å la proteinsyntesen stanse. Ribosomet kan da fortsette å lese oppskriften og produsere et fullengdes CFTR-protein. Metoden omgår dermed den feilplasserte stoppinstruksen, men reparerer ikke selve DNA-sekvensen. 14

Siden RNA-et ikke er ment å endre arvematerialet permanent, er effekten forbigående. Dersom metoden senere utvikles til behandling, vil det trolig være behov for gjentatte doser. Hvor ofte, vil avhenge av hvor lenge virkningen varer og hvor trygt behandlingen kan gjentas.

En naturlig tRNA-modifikasjon gjorde forskjellen

Umodifiserte suppressor-tRNA-er har flere utfordringer: De må være stabile lenge nok til å virke, lades med riktig aminosyre, lese effektivt forbi stoppsignalet og samtidig unngå å utløse en kraftig medfødt immunreaksjon.

Forskerne innførte en stedsspesifikk kjemisk modifikasjon som finnes naturlig i tRNA. Ifølge studien førte dette til bedre lading med aminosyre, mer effektiv lesing forbi det for tidlige stoppsignalet, lengre funksjonell aktivitet og mindre aktivering av det medfødte immunforsvaret. Kildene oppgir ikke navnet på modifikasjonen, så det er ikke grunnlag for å anta at det for eksempel var pseudouridin. 158

Modifikasjonen løste dermed flere flaskehalser samtidig. Et tRNA som kan omgå et stoppsignal, men som raskt brytes ned, lades dårlig eller gir sterk immunaktivering, vil ha begrenset terapeutisk verdi.

Inhalasjon skulle få RNA-et til lungene

Teamet utviklet også lipidnanopartikler, eller LNP-er, som var tilpasset den uvanlig strukturerte tRNA-lastens egenskaper. Forskerne testet ulike formuleringer for å finne de som leverte RNA-et mest effektivt, og ga de utvalgte partiklene gjennom inhalasjon for å konsentrere behandlingen i lungevev og luftveisceller. 18

Dette er et ikke-viralt leveringssystem. LNP-ene frakter det terapeutiske RNA-et inn i cellene, men bruker ikke et virus og setter ikke et korrigert gen permanent inn i arvematerialet. Tidligere arbeid hadde vist at LNP-leverte sup-tRNA-er kunne gjenopprette produksjonen av fungerende proteiner i musemodeller, noe som ga et utgangspunkt for den nye, lungespesifikke utformingen. 4

Hva forsøkene viste

Kombinasjonen av sup-tRNA og inhalerte LNP-er gjenopprettet CFTR-produksjon og tilknyttet kanalaktivitet i flere modeller:

• Menneskelige bronkialepitelceller: Behandlingen fremmet lesing forbi det for tidlige stoppsignalet og gjenopprettet produksjonen av fullengdes CFTR.
• Musemodeller av cystisk fibrose: Inhalasjonen nådde lungene og ga langvarig aktivitet – rapportert til opptil rundt 40 dager hos mus. Dette er et preklinisk funn og kan ikke uten videre forventes hos mennesker. 16
• Pasientavledede organoider: Metoden gjenopprettet fullengdes CFTR i en organoid med fire CFTR-varianter, inkludert to nonsense-varianter. 18

Organoidforsøket viste samtidig en viktig begrensning. Det nyproduserte CFTR-proteinet trengte fortsatt kombinasjonen elexakaftor–tezakaftor–ivakaftor, vanligvis kalt Trikafta, for optimal folding, transport til riktig sted i cellen og kanalaktivitet. Den mest sannsynlige behandlingsstrategien ved enkelte mutasjoner kan derfor være: Først gjenopprettes proteinproduksjonen, deretter forbedres proteinets funksjon. Metoden vil altså ikke nødvendigvis erstatte CFTR-modulatorer. 13

Mulig plattform for andre genetiske sykdommer

Suppressor-tRNA-er kan i prinsippet konstrueres for å gjenkjenne hver av de tre stop-kodonene. Det gjør teknologien til en mulig plattform for flere sykdommer med nonsense-mutasjoner, dersom forskerne klarer å velge riktig tRNA, sette inn en egnet aminosyre, levere nok RNA til riktig vev og samtidig bevare normal proteinsyntese.

Mulighetene er likevel ikke automatiske. Ulike proteiner kan tåle ulike aminosyresubstitusjoner, og et protein som reddes fra et for tidlig stoppsignal, kan fortsatt folde seg feil eller trenge et stabiliserende legemiddel. Levering er også vevsspesifikk. En nanopartikkelformulering som er optimalisert for inhalasjon til lungene, vil ikke nødvendigvis fungere i lever, muskler, hjerne eller nyrer. Disse organene kan kreve egne nanopartikler og andre administrasjonsmåter. 34

Sikkerhetsspørsmål gjenstår

Før metoden kan bli en behandling, må forskerne blant annet avklare:

• Kan sup-tRNA føre til uønsket lesing forbi normale stoppsignaler?
• Kan endret proteinsyntese gi skadelige biprodukter eller feil aminosyrer i andre proteiner?
• Er formuleringen trygg og effektiv ved gjentatte inhalasjoner?
• Hvor jevnt fordeler den seg i lungene, og hvor lenge forblir den aktiv?
• Kan LNP-ene eller RNA-et utløse betennelse eller andre immunreaksjoner?

Ekstern omtale har trukket frem doseavhengig betennelse hos mus og mer generelle bekymringer rundt sikkerheten ved inhalerte LNP-behandlinger. Dette må undersøkes grundig før metoden kan regnes som klinisk etablert. 613

Det viktigste fremskrittet ligger derfor i kombinasjonen av tRNA-kjemi og organrettet levering. Ved å forbedre lesingen forbi stoppsignalet, stabiliteten, ladingen med aminosyre og toleransen – samtidig som RNA-et ble rettet mot lungene – klarte forskerne å gjenopprette meningsfull CFTR-produksjon og funksjon i prekliniske og pasientavledede modeller. Neste spørsmål er om effekten kan gjentas trygt og forutsigbart hos mennesker, og om ulike CFTR-mutasjoner vil kreve kombinasjonsbehandling for at det reddede proteinet skal fungere optimalt.