AGENTEX verplaatst genetische-code-engineering van levende cellen naar de reageerbuis

AGENTEX staat voor Automated Genetic tRNA Expansion. Het systeem verandert vooral de volgorde waarin genetische codes worden ontwikkeld. Onderzoekers hoeven niet langer eerst het genoom van een organisme vrijwel volledig te herschrijven om daarna te ontdekken of een nieuwe vertaalsleutel werkt. Ze kunnen kandidaat-systemen eerst buiten de cel samenstellen, die robotisch testen en alleen de beste ontwerpen meenemen naar vervolgonderzoek in levende cellen. 6

Volgens de gerapporteerde resultaten kunnen zulke herontworpen systemen tot 34 aminozuurbouwstenen gebruiken, tegenover de 20 aminozuren van de standaard biologische code. 7 De doorbraak is niet dat er meer dan 64 codons ontstaan, maar dat meer van die bestaande codons bruikbaar worden voor alternatieve toewijzingen.

De beperking van de standaard genetische code

De standaard genetische code koppelt 64 mogelijke tripletcodons aan aminozuren en aan start- of stopsignalen. Omdat meerdere codons hetzelfde aminozuur kunnen aanduiden, bevat de code veel redundantie. Juist die redundantie biedt ruimte om codons opnieuw toe te wijzen.

In een levende cel is dat riskant. Hetzelfde codon kan op talloze plaatsen in essentiële genen voorkomen. Geef je het codon een nieuwe betekenis, dan kunnen veel bestaande eiwitten verkeerd worden opgebouwd. Een cellulaire aanpak vereist daarom vaak dat onderzoekers iedere relevante codonkopie in het genoom vervangen of verwijderen. Tegelijk moet de natuurlijke vertaalsmachinerie niet concurreren met het ontworpen systeem.

AGENTEX verplaatst de eerste test naar een celvrije reactie. Onderzoekers leveren daar een aangepaste verzameling vertaalelementen aan en kunnen controleren of een voorgestelde codon-aminozuurkaart inderdaad het bedoelde eiwit of peptide oplevert, zonder vooraf een volledig organisme genetisch te modificeren. 615

Hoe de alternatieve codes werken

Een codon wordt geïnterpreteerd door een samenspel van boodschapper-RNA, transfer-RNA (tRNA) en de overige onderdelen van de translatiemachinerie. AGENTEX richt zich op het opnieuw ontwerpen van die moleculaire relaties, in plaats van de natuurlijke genetische code als onveranderlijk uitgangspunt te behandelen.

De onderzoekers bestudeerden onder meer ontworpen ribosomen, tRNA’s en aminoacyl-tRNA-synthetasen. Dat zijn de enzymen die aminozuren aan tRNA’s koppelen. De onderdelen moesten elkaar goed herkennen, maar zo min mogelijk interfereren met het standaard vertaalsysteem. Daarnaast werden geautomatiseerde methoden gebruikt om bibliotheken met synthetische tRNA’s te screenen op aminozuurlading. 6

Zo kunnen geselecteerde codons aan andere aminozuren worden gekoppeld, waaronder niet-standaard aminozuren, in een doelbewust opnieuw opgebouwde celvrije reactie. Eerder onderzoek had al laten zien dat celvrije systemen met in vitro getranscribeerde tRNA’s eiwitten kunnen maken volgens een vereenvoudigde of verwisselde genetische code. 5 AGENTEX bouwt daarop voort met een geautomatiseerde workflow waarin veel ontwerpen naast elkaar kunnen worden getest.

De aangeleverde rapportage beschrijft twee herontworpen genetische codes die naast de standaardcode zijn onderzocht. Daarbij werden maximaal drie codons opnieuw toegewezen en niet-standaard aminozuren ingebouwd. 8 Omdat elk alternatief systeem zijn eigen compatibele vertaalelementen gebruikt, kunnen verschillende codeontwerpen binnen hetzelfde experimentele raamwerk worden vergeleken. De systemen zijn zo ontworpen dat ze elkaar niet onnodig in de weg zitten.

Waarom robotisering het verschil maakt

Een genetische code is niet alleen een tabel met codons. Voor een nieuwe toewijzing moeten de juiste tRNA’s het bedoelde codon herkennen, moeten de bijbehorende synthetasen die tRNA’s met het correcte aminozuur laden en moet het ribosoom de ontstane complexen voldoende nauwkeurig en efficiënt verwerken. In celvrije vertaalsystemen kunnen onderzoekers deze onderdelen afzonderlijk toevoegen, weglaten of vervangen. 1516

AGENTEX ondersteunt daarmee een snelle ontwerp-bouw-testcyclus:

1. Ontwerpen: kies een kandidaatcodontabel en de vertaalelementen die nodig zijn om die uit te voeren.
2. Bouwen: combineer de gewenste tRNA’s, synthetasen en ribosomen in een celvrije reactie.
3. Testen: meet aminozuurlading, eiwitproductie en de inbouw van geselecteerde aminozuren.
4. Vergelijken: beoordeel opbrengst, nauwkeurigheid en orthogonaliteit — de mate waarin het ontworpen systeem gescheiden blijft van het standaard systeem.
5. Selecteren: schuif alleen de meest veelbelovende ontwerpen door naar complexere experimenten in cellen.

Het praktische voordeel is schaal en snelheid. Een mislukt ontwerp kan als reactie worden weggegooid, in plaats van te eindigen als een mislukt project voor genetische modificatie van een organisme. Een werkend ontwerp kan eerst worden verfijnd, voordat onderzoekers beginnen aan genome-wide editing, stamconstructie en biologische validatie. 6

Wat AGENTEX nog niet oplost

AGENTEX demonstreert een vertaalsysteem in vitro. Het maakt daarmee niet automatisch een levensvatbare cel die een sterk aangepaste genetische code kan onderhouden, repliceren en reguleren.

Voor toepassing in levende cellen blijven onder meer deze problemen bestaan:

• Compatibiliteit met het volledige genoom: opnieuw toegewezen codons moeten mogelijk overal worden vervangen of verwijderd om te voorkomen dat natuurlijke eiwitten verkeerd worden vertaald.
• Beheersing van de vertaalelementen: ontworpen tRNA’s, synthetasen en mogelijk ribosomen moeten betrouwbaar functioneren naast — of in plaats van — de natuurlijke machinerie.
• Beschikbaarheid van aminozuren: een cel moet elk niet-standaard aminozuur opnemen of zelf maken en het naar de juiste route brengen.
• Selectieve lading: synthetasen moeten het juiste aminozuur aan het juiste tRNA koppelen en ongewenste kruisreacties vermijden. 5
• Prestaties en stabiliteit: het systeem moet voldoende eiwitproductie, nauwkeurigheid, groei en overerving behouden.

Recente cellulaire resultaten laten zien hoe groot die uitdaging is. In een zoogdiersysteem werden maximaal vijf verschillende synthetische aminozuren in één eiwit ingebouwd door zeldzame codons opnieuw te gebruiken. 4 Dat is een belangrijke stap in levende cellen, maar iets anders dan een stabiel, zichzelf replicerend organisme met de volledige AGENTEX-achtige code van 34 aminozuren. De aangeleverde informatie toont niet aan dat zo’n organisme al is gebouwd.

Mogelijke toepassingen

Meer ruimte voor eiwitengineering

Natuurlijke eiwitten worden opgebouwd uit een relatief kleine verzameling aminozuren. Met uitgebreidere genetische codes kunnen onderzoekers eiwitten en peptidebiopolymeren maken met chemische groepen, zijketens of ruggengraatstructuren die de gewone translatie niet kan leveren. Het AGENTEX-onderzoek koppelt het platform specifiek aan peptidebiopolymeersynthese en het op aanvraag prototypen van genetische codes. 6

Nieuwe kandidaten voor geneesmiddelen

Niet-standaard aminozuren kunnen eigenschappen toevoegen die interessant zijn voor geneesmiddelenonderzoek, zoals een gewijzigde reactiviteit, grotere stabiliteit of mogelijkheden voor gecontroleerde koppeling aan andere moleculen. AGENTEX kan het vroege screenen van zulke ontwerpen versnellen. Dat is een voordeel voor ontdekking en ontwikkeling, geen bewijs dat een specifiek AGENTEX-product al een geneesmiddel is. Voor klinische toepassing blijven onderzoek naar werkzaamheid, veiligheid, toediening en productie noodzakelijk.

Programmeerbare materialen

Ribosomen maken synthese met een nauwkeurig bepaalde sequentie mogelijk. In combinatie met een grotere verzameling chemische bouwstenen kan dat leiden tot biomaterialen met nieuwe bindende, katalytische, optische, mechanische of zelfassemblerende eigenschappen. Celvrije systemen hebben al actieve eiwitten geproduceerd met aangepaste codeverdelingen, wat een basis vormt voor dit soort experimenten. 5

Een mogelijke route naar genetische isolatie

Een voldoende afwijkende genetische code zou er in de toekomst voor kunnen zorgen dat een ontworpen organisme minder gemakkelijk functionele genetische informatie uitwisselt met natuurlijke organismen of door gewone biologische parasieten wordt ondersteund. AGENTEX bewijst dat resultaat niet. De directe bijdrage is bescheidener maar praktisch belangrijk: onderzoekers kunnen kandidaat-orthogonale codes vergelijken voordat ze proberen één ervan in een levende, zichzelf voortplantende soort te installeren.

Verschil met eerdere benaderingen

Bij traditionele uitbreiding van de genetische code wordt vaak één niet-standaard aminozuur gekoppeld aan een stopcodon. Een andere route is het vrijmaken van een klein aantal codons door omvangrijke genome-wide aanpassingen. Eerder onderzoek beschreef ook bredere systemen, waaronder een code met 68 codons die vier verschillende niet-canonieke aminozuren in één eiwit kon inbouwen. Celvrije studies hebben daarnaast verwisselde of vereenvoudigde codes gemaakt met ontworpen of in vitro getranscribeerde tRNA’s. 35

De onderscheidende bijdrage van AGENTEX is daarom minstens zozeer de workflow als het aantal aminozuren: geautomatiseerd en parallel prototypen van vertaalsystemen voordat een cel wordt hercodeerd. Het platform vormt een extra testlaag tussen een theoretisch codeontwerp en een levend organisme. Die laag kan incompatibiliteiten eerder zichtbaar maken, mislukte inspanningen voorkomen en het aantal codearchitecturen dat onderzoekers praktisch kunnen onderzoeken vergroten.

De belangrijkste kanttekening blijft echter overeind: AGENTEX maakt alternatieve genetische codes eenvoudiger te prototypen, maar laat de biologische en technische problemen van het gebruik ervan in levende cellen niet verdwijnen.