WHOLISTIC mostra i segnali cellulari nell’intero corpo di un pesce zebra vivo

La fisiologia non procede per compartimenti isolati: attività neurale, circolazione, digestione e risposte sensoriali possono cambiare nello stesso momento. Finora, però, l’imaging su animali vivi ha spesso permesso di guardare un tessuto o un organo alla volta.

WHOLISTIC — acronimo di WHole Organism Live Imaging System for recording Tissue and IntraCellular activity — è stato sviluppato per colmare questa lacuna nelle giovani larve trasparenti di pesce zebra (Danio rerio). La tecnica integra imaging 3D rapido a fluorescenza, sensori del calcio codificati geneticamente e analisi computazionale, così da seguire nel tempo l’attività cellulare dell’intero organismo su scale dell’ordine dei secondi. 2

Come funziona

Le larve di pesce zebra sono particolarmente adatte perché la loro trasparenza rende accessibili otticamente i tessuti interni. Gli animali esprimono diffusamente sensori del calcio: le variazioni della fluorescenza costituiscono un indicatore delle dinamiche del calcio intracellulare.

È un dato utile per rilevare cambiamenti di stato delle cellule, ma va interpretato con cautela: l’attività del calcio non misura direttamente le connessioni sinaptiche e non dimostra, da sola, che una cellula abbia causato la risposta di un’altra. 2

Il salto tecnico di WHOLISTIC è un flusso di lavoro integrato:

• Microscopia volumetrica a fluorescenza, che acquisisce ripetutamente una vista tridimensionale dell’animale invece di un solo piano di imaging. 2
• Marcatura del calcio in molte tipologie cellulari, per osservare l’attività in sistemi e cellule diversi, non soltanto nei neuroni. 2
• Elaborazione computazionale e apprendimento automatico, utili a individuare strutture cellulari attive e a organizzare le grandi registrazioni in schemi interpretabili. 2

Il risultato è una registrazione in tempo reale delle dinamiche cellulari attraverso l’organismo. Non si tratta soltanto di una maggiore copertura visiva: consente di cercare, nella stessa preparazione sperimentale, possibili collegamenti funzionali tra organi. 2

Cosa ha rivelato l’imaging dell’intero organismo

Ipossia: il sangue viene ridistribuito

In condizioni di scarso ossigeno, WHOLISTIC ha rilevato attività coordinate associate a cambiamenti della circolazione, compresa una ridistribuzione del flusso sanguigno. La galleria di Janelia mostra una diminuzione del flusso nella regione mesenterica durante l’ipossia, accompagnata da un aumento del flusso verso cervello e cuore. 8

Osservazioni di questo tipo mettono nello stesso quadro risposte neurali e cardiovascolari. Sono coerenti con una risposta coordinata dell’organismo che dà priorità all’apporto di ossigeno agli organi vitali; il circuito causale preciso, tuttavia, richiede esperimenti mirati successivi. 28

Midollo spinale e cellule ependimali

La piattaforma ha inoltre individuato dinamiche coordinate nel midollo spinale e nelle cellule ependimali, che rivestono il sistema ventricolare. Il dato porta l’attenzione oltre le tradizionali mappe incentrate soltanto sui neuroni. 2

L’osservazione genera ipotesi da verificare: un’attività delle cellule ependimali legata a determinati stati potrebbe essere rilevante per la fisiologia associata al sonno, ma le correlazioni del calcio non bastano a dimostrare una funzione nel sonno. WHOLISTIC permette di identificare questi candidati in più tessuti e poi testarli con perturbazioni più selettive. 2

Gli effetti della ketamina oltre il tessuto neurale

Le risposte ai farmaci possono interessare più tipi cellulari e più compartimenti anatomici. Con WHOLISTIC, i ricercatori hanno esaminato l’esposizione acuta alla ketamina e osservato effetti che coinvolgono sia il tessuto neurale sia le meningi, le membrane che avvolgono cervello e midollo spinale. 2

È un esempio pratico del valore dell’approccio: una misura limitata ai neuroni potrebbe trascurare risposte nei tessuti non neurali vicini. L’imaging dell’intero organismo rende visibili questi effetti attraverso i confini tra tessuti nello stesso esperimento. 2

Cellule associate alla cartilagine sensibili al freddo

Esperimenti di raffreddamento hanno rivelato risposte del calcio anche in cellule associate alla cartilagine. L’osservazione suggerisce che l’attività legata alla temperatura non sia confinata al sistema nervoso e mostra come un imaging cellulare ampio possa far emergere possibili ruoli sensoriali inattesi di tessuti non neuronali. 2

Perché WHOLISTIC è importante

WHOLISTIC estende all’intero corpo la logica dell’imaging dell’intero cervello nel pesce zebra. Quest’ultimo aveva già dimostrato che un vertebrato trasparente può consentire registrazioni su larga scala dell’attività neurale; il nuovo approccio amplia lo sguardo a più sistemi di organi e tipi cellulari in contemporanea. 52

La differenza conta soprattutto per domande che attraversano più sistemi: come il cervello coordina la circolazione sotto stress, come un farmaco agisce su tessuti neurali e non neurali, oppure come i segnali sensoriali siano rappresentati al di fuori delle vie nervose più studiate. WHOLISTIC non pretende di fornire una mappa causale completa: offre una mappa dell’attività dell’intero corpo, utile per individuare relazioni da verificare sperimentalmente. 2

Una direzione estendibile

Janelia presenta il lavoro come una risorsa fondata su microscopia avanzata e analisi computazionale; il sito di WHOLISTIC include anche visualizzazioni, tra cui quelle dei cambiamenti circolatori associati all’ipossia. 28

L’approccio potrebbe inoltre essere utile oltre le larve di pesce zebra. Danionella è un modello promettente perché gli adulti restano estremamente piccoli, rendendo possibile la registrazione dell’attività dell’intero cervello in animali con repertori comportamentali più sviluppati. Separatamente, Janelia riferisce che il suo flusso di lavoro per la microscopia a espansione dell’intero corpo funziona anche su campioni maturi di Danionella. 114

Resta essenziale il limite interpretativo: l’imaging del calcio mostra dinamiche cellulari correlate. Non identifica automaticamente tutte le connessioni dirette, i meccanismi molecolari o i rapporti di causa-effetto. Il punto di forza di WHOLISTIC è rendere osservabili, in un vertebrato vivo, ipotesi che coinvolgono più organi e che prima erano difficili da studiare alla stessa scala. 2