AGENTEX riprogetta il codice genetico senza riscrivere una cellula

AGENTEX, acronimo di Automated Genetic tRNA Expansion, cambia il modo in cui si può affrontare l’ingegneria del codice genetico. Invece di riscrivere prima il genoma di un organismo e scoprire solo dopo se il nuovo sistema di traduzione funziona, i ricercatori possono assemblare diverse configurazioni in vitro, sottoporle a test robotizzati e portare avanti soltanto i progetti più promettenti. 6

Il lavoro descritto supporta sistemi riprogettati capaci di utilizzare fino a 34 componenti amminoacidici, contro i 20 del codice biologico standard. 7 Il risultato non consiste nell’aumentare il numero fondamentale di codoni, che resta pari a 64, ma nel rendere utilizzabili più codoni con assegnazioni alternative.

Il limite che AGENTEX prova ad aggirare

Il codice genetico standard associa i 64 possibili codoni — triplette di basi — a 20 amminoacidi, oltre ai segnali di inizio e di stop. Poiché diversi codoni possono indicare lo stesso amminoacido, questa ridondanza crea margini per riassegnarne alcuni.

In una cellula viva, però, cambiare il significato di un codone è rischioso. Lo stesso segnale può comparire in moltissimi geni essenziali: assegnargli un nuovo amminoacido può quindi provocare errori di traduzione su larga scala. Per procedere sarebbe spesso necessario sostituire o eliminare dal genoma tutte le occorrenze di quel codone e, allo stesso tempo, impedire che il sistema di traduzione naturale entri in competizione con quello ingegnerizzato.

AGENTEX porta il primo esperimento fuori dalla cellula. I ricercatori forniscono una combinazione personalizzata di componenti della traduzione e verificano se una determinata mappa codone-amminoacido produce la proteina o il peptide previsto, prima di affrontare una modifica genomica su scala globale. 615

Come funzionano i codici riprogettati

Un codone viene interpretato attraverso l’interazione tra RNA messaggero, RNA di trasferimento — o tRNA — e apparato di traduzione. AGENTEX interviene su queste relazioni molecolari, invece di considerare il codice naturale come immutabile.

Il lavoro ha esaminato ribosomi, tRNA e aminoacil-tRNA sintetasi, gli enzimi che caricano gli amminoacidi sui tRNA, progettati per riconoscersi reciprocamente e per restare separati dal sistema di traduzione standard. La piattaforma utilizza inoltre metodi automatizzati per analizzare librerie di tRNA sintetici e verificare quali vengano caricati con l’amminoacido corretto. 6

In questo modo, alcuni codoni possono essere associati ad amminoacidi diversi da quelli naturali, compresi amminoacidi non standard, all’interno di una reazione ricostituita e priva di cellule. Sistemi precedenti basati su tRNA trascritti in vitro avevano già dimostrato che la traduzione poteva funzionare con codici semplificati o scambiati; AGENTEX estende questo principio a un flusso di prototipazione automatizzato e multiplex. 5

I dati riportati descrivono due codici genetici riprogettati analizzati accanto a quello standard, con la riassegnazione di fino a tre codoni e l’inserimento di amminoacidi non standard. 8 Poiché ogni configurazione usa componenti di traduzione compatibili con la propria interpretazione, diversi progetti possono essere confrontati nello stesso quadro sperimentale senza imporre una nuova lettura a un genoma vivente.

Perché l’automazione è importante

Un codice genetico non è soltanto una tabella. Perché una riassegnazione funzioni, i tRNA devono riconoscere i codoni giusti, le sintetasi devono caricarli con l’amminoacido previsto e il ribosoma deve accettare i complessi con precisione ed efficienza sufficienti. In un sistema cell-free questi elementi possono essere aggiunti, rimossi o sostituiti singolarmente. 1516

AGENTEX sfrutta questo controllo per organizzare un ciclo di progettazione, costruzione e verifica:

1. Progettare una tabella di codoni candidata e i componenti necessari per applicarla.
2. Costruire le combinazioni di tRNA, sintetasi e ribosomi in una reazione priva di cellule.
3. Testare il caricamento dei tRNA, la traduzione e l’incorporazione degli amminoacidi selezionati.
4. Confrontare resa, fedeltà e separazione dal sistema standard tra numerose configurazioni.
5. Selezionare soltanto i progetti più solidi per gli esperimenti biologici successivi.

Il vantaggio pratico è duplice: velocità e ampiezza dello screening. Un progetto fallito può essere eliminato come semplice reazione di laboratorio, senza trasformarsi in un costoso tentativo di ingegneria di un organismo. Un progetto riuscito può essere perfezionato prima di affrontare il genome editing, la costruzione di un ceppo e la validazione in cellule. 6

Che cosa AGENTEX non ha ancora risolto

AGENTEX dimostra una piattaforma di traduzione in vitro. Da sola, non crea un organismo capace di mantenere, replicare e regolare stabilmente un codice genetico profondamente riprogettato.

Il trasferimento in una cellula richiederebbe ancora diversi passaggi complessi:

• Compatibilità con l’intero genoma: i codoni riassegnati potrebbero dover essere rimossi o sostituiti ovunque, per evitare errori nelle proteine naturali.
• Controllo dei componenti: tRNA, sintetasi e, in alcuni casi, ribosomi ingegnerizzati dovrebbero funzionare in modo affidabile insieme — o al posto — dell’apparato cellulare nativo.
• Disponibilità degli amminoacidi: la cellula dovrebbe ottenere o sintetizzare ogni amminoacido non standard e indirizzarlo verso la corretta via di traduzione.
• Caricamento selettivo: le sintetasi dovrebbero legare l’amminoacido previsto al tRNA corretto, evitando reazioni incrociate indesiderate. 5
• Prestazioni biologiche: il sistema dovrebbe mantenere resa proteica, accuratezza, crescita e trasmissione ereditaria adeguate nel tempo.

Studi cellulari recenti mostrano la portata del problema. Un sistema mammifero ha riferito l’inserimento di fino a cinque amminoacidi sintetici distinti nella stessa proteina, riutilizzando codoni rari. 4 È un risultato cellulare significativo, ma diverso dalla dimostrazione di un organismo stabile e autoriproducente basato sul progetto AGENTEX a 34 amminoacidi. Il materiale fornito non dimostra che un organismo di questo tipo sia già stato costruito.

Che cosa potrebbe rendere possibile

Un alfabeto chimico più ampio per le proteine

Le proteine naturali vengono assemblate a partire da un insieme relativamente ristretto di mattoni molecolari. Codici più flessibili potrebbero permettere di esplorare proteine e biopolimeri peptidici con gruppi chimici, catene laterali o strutture dello scheletro non disponibili nella traduzione ordinaria. Il lavoro su AGENTEX collega esplicitamente la piattaforma alla sintesi di biopolimeri peptidici e alla prototipazione su richiesta di codici genetici. 6

Nuove possibilità per la scoperta di farmaci

Gli amminoacidi non standard possono offrire reattività, stabilità o opportunità di coniugazione controllata diverse da quelle dei componenti naturali. AGENTEX potrebbe quindi rendere più semplice esaminare molti progetti molecolari nelle fasi iniziali della ricerca. Si tratta però di un vantaggio per la scoperta e l’ingegneria, non della prova che un prodotto AGENTEX sia già un farmaco: ogni applicazione terapeutica dovrebbe comunque superare le normali verifiche di efficacia, sicurezza, distribuzione e produzione.

Materiali programmabili

La sintesi ribosomiale garantisce un controllo preciso della sequenza. Unendo questo controllo a un insieme più ampio di mattoni chimici, si potrebbero studiare biomateriali con proprietà nuove di legame, catalisi, risposta ottica, resistenza meccanica o autoassemblaggio. Sistemi cell-free avevano già prodotto proteine attive con codici riprogettati, fornendo una base per questo tipo di sperimentazione. 5

Un possibile percorso verso l’isolamento genetico

Un codice sufficientemente diverso da quello naturale potrebbe, in futuro, rendere più difficile per un organismo ingegnerizzato scambiare informazioni genetiche funzionali con gli organismi naturali o sostenere i normali parassiti biologici. AGENTEX non dimostra questo risultato. Il suo contributo più immediato è permettere il confronto tra diversi codici potenzialmente ortogonali prima di tentare l’installazione di uno di essi in un sistema vivente e riproduttivo.

Il confronto con gli approcci precedenti

L’espansione tradizionale del codice genetico parte spesso dall’assegnazione di un amminoacido non standard a un codone di stop oppure dalla liberazione di pochi codoni attraverso modifiche estese del genoma. Altri lavori hanno prodotto sistemi più ampi, tra cui un codice a 68 codoni capace di incorporare quattro amminoacidi non canonici distinti nella stessa proteina. La ricerca cell-free aveva inoltre già realizzato codici scambiati o semplificati utilizzando tRNA ingegnerizzati o trascritti in vitro. 35

La novità di AGENTEX sta quindi tanto nel flusso di lavoro quanto nel numero di amminoacidi: la piattaforma automatizza la prototipazione multiplex di sistemi di traduzione prima della ricodifica cellulare. Crea uno strato di screening tra l’idea teorica di un codice genetico e un organismo vivente. Questo potrebbe ridurre il lavoro sprecato, far emergere prima le incompatibilità e ampliare il numero di architetture che i ricercatori possono mettere alla prova.

La cautela centrale resta però invariata: AGENTEX rende più semplice prototipare codici genetici alternativi, ma non fa scomparire i problemi biologici e ingegneristici necessari per farli funzionare dentro una cellula.