Un tRNA ingegnerizzato supera le mutazioni “stop” associate alla fibrosi cistica

Un gruppo guidato dall’Università di Toronto ha messo a punto una strategia a base di RNA per una forma di fibrosi cistica causata dalle cosiddette mutazioni nonsense: errori genetici che introducono un segnale di stop prematuro nelle istruzioni usate dalla cellula per produrre una proteina.

Invece di modificare direttamente il gene CFTR, i ricercatori hanno fornito alle cellule un tRNA soppressore ingegnerizzato, o sup-tRNA, progettato per riconoscere quel segnale anomalo e consentire alla sintesi proteica di proseguire. L’obiettivo è produrre una proteina CFTR completa, capace di funzionare come canale per gli ioni cloruro. 1

I risultati sono stati osservati in cellule epiteliali bronchiali, modelli murini e organoidi di fibrosi cistica derivati da pazienti. Si tratta però di una piattaforma preclinica promettente, non ancora di una terapia dimostrata nell’essere umano.

Il problema: il segnale di stop interrompe la produzione di CFTR

Durante la traduzione, il macchinario cellulare legge l’RNA messaggero e assembla la proteina. Una mutazione nonsense inserisce un segnale di terminazione nel punto sbagliato: la sintesi si interrompe troppo presto e il risultato è una proteina CFTR tronca, oppure una quantità insufficiente di proteina completa.

Questo limite distingue le mutazioni nonsense da altri difetti del CFTR. I modulatori, come Trikafta, migliorano il ripiegamento, il trasporto o l’attività della proteina che la cellula è riuscita a produrre. Se il segnale di stop impedisce la formazione di una proteina completa, questi farmaci potrebbero non essere sufficienti da soli. La ricerca si concentra quindi su un sottogruppo di pazienti con mutazioni nonsense, stimato intorno a una persona su dieci tra quelle con fibrosi cistica e spesso poco responsivo ai modulatori CFTR. 12

Il problema potrebbe avere una portata più ampia: le mutazioni nonsense sono stimate come responsabili di circa l’11% delle malattie genetiche ereditarie. Una tecnica capace di correggere in sicurezza questo errore di traduzione potrebbe, in linea di principio, essere adattata anche ad altre patologie. 2

Come il tRNA fa da “bypass” biologico

Il tRNA, o RNA di trasferimento, porta normalmente gli amminoacidi alla macchina cellulare che costruisce le proteine. I ricercatori hanno modificato alcuni tRNA creando anticodoni in grado di riconoscere un codone di terminazione prematuro presente nell’RNA messaggero del CFTR mutato.

Quando il sup-tRNA raggiunge quel segnale di stop errato, inserisce un amminoacido al suo posto. Il ribosoma può così continuare a leggere l’RNA e completare la produzione della proteina CFTR. In pratica, la strategia aggira l’istruzione di stop inserita nel posto sbagliato invece di correggere la sequenza del DNA. 14

L’approccio è pensato per essere temporaneo e non virale: non modifica stabilmente il genoma. Se arrivasse alla sperimentazione clinica, sarebbe quindi probabilmente necessario somministrare il trattamento più volte. La frequenza delle dosi dipenderebbe dalla durata dell’attività e dalla sicurezza delle somministrazioni ripetute.

La modifica chimica ha migliorato stabilità e attività

I sup-tRNA non modificati devono superare diversi ostacoli: devono restare integri abbastanza a lungo, essere caricati con l’amminoacido corretto, favorire il superamento del codone di stop e non attivare eccessivamente la risposta immunitaria innata.

Il gruppo di ricerca ha introdotto in un punto preciso una modifica chimica presente naturalmente nei tRNA. Secondo i risultati riportati, questa modifica ha migliorato il caricamento del tRNA con l’amminoacido, aumentato l’efficienza del “readthrough” del segnale di stop, prolungato l’attività funzionale e ridotto l’attivazione immunitaria innata. 158

Le fonti disponibili non indicano il nome della modifica. Non è quindi possibile attribuirla, senza ulteriori prove, a una sostanza specifica come la pseudouridina. 1

Il risultato è importante perché affronta più di un problema contemporaneamente: un tRNA capace di superare il codone di stop, ma rapidamente degradato, scarsamente caricato o fortemente immunostimolante, avrebbe un’utilità terapeutica limitata.

Perché usare nanoparticelle lipidiche inalabili

I ricercatori hanno inoltre sviluppato formulazioni di nanoparticelle lipidiche, o LNP, adattate alla struttura particolare del tRNA. Dopo aver confrontato diverse formulazioni per valutarne la capacità di trasporto, hanno somministrato quelle selezionate per inalazione, con l’obiettivo di concentrare l’RNA nei polmoni e nelle cellule delle vie aeree. 18

Le LNP sono un sistema di distribuzione non virale: trasportano l’RNA all’interno delle cellule senza utilizzare un vettore virale e senza inserire stabilmente un gene corretto. Il lavoro si basa anche su studi precedenti, nei quali sup-tRNA veicolati da nanoparticelle lipidiche avevano ripristinato la produzione di proteine funzionanti in modelli murini. 4

Cosa hanno mostrato i modelli sperimentali

La combinazione tra sup-tRNA modificato e LNP somministrate per inalazione ha prodotto risultati in più sistemi:

• Cellule epiteliali bronchiali umane: il trattamento ha favorito il superamento del codone di terminazione prematuro e la produzione di CFTR a lunghezza completa.
• Modelli murini di fibrosi cistica: le particelle inalate hanno raggiunto i polmoni e l’attività è rimasta rilevabile fino a circa 40 giorni nei topi. Questa durata non può essere automaticamente estesa agli esseri umani. 16
• Organoidi derivati da pazienti: la strategia ha ripristinato la produzione di CFTR completa in un organoide portatore di quattro varianti del gene, comprese due mutazioni nonsense. 18

L’organoide ha però evidenziato anche un limite decisivo. La proteina CFTR appena prodotta ha avuto bisogno della combinazione elexacaftor–tezacaftor–ivacaftor, commercializzata come Trikafta, per ottenere un ripiegamento, un trasporto verso la membrana e un’attività del canale ottimali. La logica terapeutica potrebbe quindi essere, almeno per alcune mutazioni, ripristinare prima la produzione della proteina e poi migliorarne il funzionamento. Il sup-tRNA non sostituirebbe necessariamente i modulatori CFTR. 13

Un possibile approccio per molte malattie genetiche

In teoria, è possibile progettare sup-tRNA diretti contro ciascuno dei tre codoni di stop. Questo rende la tecnica una possibile piattaforma basata sul tipo di mutazione, non su una sola malattia.

L’adattamento ad altri disturbi non sarebbe però automatico. Proteine diverse potrebbero tollerare in modo diverso l’amminoacido inserito al posto del segnale di stop. Inoltre, una proteina recuperata potrebbe continuare a ripiegarsi male o aver bisogno di un farmaco stabilizzante. Anche la distribuzione nell’organismo rappresenta una sfida: una LNP ottimizzata per l’inalazione e per il tessuto polmonare non funzionerebbe necessariamente allo stesso modo nel fegato, nei muscoli, nel cervello o nei reni. Per ciascun organo potrebbero servire particelle e vie di somministrazione differenti. 34

Le domande di sicurezza sono ancora aperte

Prima di parlare di una possibile applicazione clinica, restano da chiarire diversi aspetti:

• il sup-tRNA potrebbe favorire il superamento involontario di normali codoni di stop?
• la traduzione alterata potrebbe generare proteine indesiderate o sostituzioni amminoacidiche dannose?
• la formulazione è tollerabile ed efficace dopo dosi inalate ripetute?
• quanto uniformemente si distribuisce nei polmoni e per quanto tempo resta attiva?
• RNA e nanoparticelle lipidiche potrebbero provocare infiammazione o altre reazioni immunitarie?

Alcuni commenti esterni hanno richiamato l’attenzione su fenomeni infiammatori dipendenti dalla dose nei topi e sulle più ampie questioni di sicurezza respiratoria associate alle LNP inalate. Questi aspetti dovranno essere valutati con studi specifici prima di considerare la tecnologia una terapia consolidata. 613

Il principale passo avanti dello studio è l’integrazione tra chimica del tRNA e distribuzione mirata a un organo. La modifica ha migliorato readthrough, durata, caricamento dell’amminoacido e tollerabilità, mentre le LNP hanno portato il cargo nei polmoni. Il risultato è stato il recupero di una produzione e di una funzione significative di CFTR in modelli preclinici e derivati da pazienti.

La prossima verifica sarà molto più impegnativa: capire se lo stesso effetto potrà essere ottenuto nelle persone in modo sicuro, ripetibile e prevedibile, e stabilire quali mutazioni richiederanno una combinazione tra sup-tRNA e modulatori CFTR.