tRNA Rekayasa Menjadi “Jalan Pintas” untuk Mutasi CFTR pada Fibrosis Kistik

Tim yang dipimpin peneliti University of Toronto mengembangkan strategi RNA nonviral untuk fibrosis kistik yang disebabkan oleh mutasi nonsense—kesalahan genetik yang memasukkan sinyal berhenti terlalu dini ke dalam instruksi pembuatan protein. Alih-alih mengedit gen CFTR secara permanen, para peneliti memasukkan tRNA supresor rekayasa (suppressor transfer RNA atau sup-tRNA) yang dirancang untuk membaca melewati sinyal berhenti tersebut. Dengan begitu, sel dapat melanjutkan proses penerjemahan dan menghasilkan protein CFTR utuh. 1

Pendekatan ini berhasil diuji pada sel epitel bronkus manusia, model tikus, dan organoid fibrosis kistik yang berasal dari pasien. Namun, hasil tersebut masih berada pada tahap praklinis dan belum membuktikan bahwa terapi ini aman atau efektif pada manusia.

Masalahnya: sinyal berhenti membuat CFTR terpotong

Mutasi nonsense membuat mesin pembuat protein di dalam sel menghentikan proses penerjemahan terlalu cepat. Pada gen CFTR, akibatnya sel dapat menghasilkan sangat sedikit protein utuh—atau tidak menghasilkan protein utuh sama sekali—padahal CFTR diperlukan sebagai saluran klorida pada permukaan sel saluran napas.

Hal ini menjelaskan mengapa kelompok pasien tertentu belum dapat terbantu secara memadai oleh obat modulator CFTR. Obat seperti Trikafta dirancang untuk memperbaiki pelipatan, pengiriman ke permukaan sel, atau aktivitas CFTR yang sudah diproduksi. Obat tersebut tidak dapat sepenuhnya mengatasi kondisi ketika sinyal berhenti dini mencegah terbentuknya protein CFTR lengkap. 12

Karena itu, strategi baru ini menyasar subkelompok pasien dengan mutasi nonsense CFTR, yang diperkirakan mencakup sekitar 10% pasien fibrosis kistik. Mutasi nonsense juga diperkirakan berkontribusi pada sekitar 11% kelainan genetik bawaan. Karena jenis kesalahan penerjemahan yang sama dapat muncul pada banyak gen, strategi readthrough yang aman berpotensi dikembangkan untuk penyakit lain. 2

Cara tRNA supresor melewati mutasi

Dalam keadaan normal, tRNA mencocokkan kodon pada RNA pembawa pesan dengan asam amino yang tepat selama proses penerjemahan protein. Peneliti kemudian merekayasa tRNA dengan antikodon yang dapat mengenali kodon terminasi prematur pada RNA pembawa pesan CFTR yang bermutasi.

Ketika sup-tRNA mencapai sinyal berhenti yang keliru itu, molekul tersebut memasukkan asam amino alih-alih membiarkan proses penerjemahan berakhir. Ribosom kemudian dapat melanjutkan pembacaan RNA dan menghasilkan protein CFTR utuh. Jadi, pendekatan ini bekerja seperti jalan pintas biologis: melewati instruksi berhenti yang salah, bukan memperbaiki urutan DNA secara langsung. 14

Karena RNA ini tidak dirancang untuk mengubah genom secara permanen, efeknya bersifat sementara. Jika kelak dikembangkan menjadi terapi, kemungkinan diperlukan pemberian ulang. Seberapa sering dosis harus diberikan akan bergantung pada lamanya aktivitas sup-tRNA dan keamanan pemberian berulang.

Modifikasi kimia meningkatkan kinerja tRNA

Sup-tRNA tanpa modifikasi menghadapi beberapa hambatan. Molekul tersebut harus cukup stabil untuk bertahan di dalam sel, diisi dengan asam amino yang benar, mampu mendorong readthrough secara efisien, dan tidak memicu respons imun bawaan secara berlebihan.

Tim peneliti menambahkan modifikasi kimia pada lokasi tertentu yang secara alami ditemukan pada tRNA. Menurut hasil penelitian, modifikasi ini meningkatkan proses pengisian tRNA dengan asam amino, memperbaiki efisiensi pelewatan kodon berhenti prematur, memperpanjang aktivitas fungsional, dan menurunkan aktivasi sistem imun bawaan. 158

Sumber yang tersedia tidak menyebutkan nama pasti modifikasi tersebut. Karena itu, modifikasi ini tidak dapat begitu saja disebut sebagai senyawa tertentu, misalnya pseudouridina. 158

Keuntungan modifikasi tersebut adalah kemampuannya mengatasi beberapa masalah sekaligus. tRNA yang mampu melewati kodon berhenti tetapi cepat rusak, tidak terisi asam amino dengan benar, atau memicu peradangan tetap akan memiliki manfaat terapi yang terbatas.

Mengapa pengirimannya diarahkan ke paru-paru

Para peneliti juga mengembangkan formulasi nanopartikel lipid atau LNP yang disesuaikan dengan struktur tRNA yang relatif rumit. Berbagai formulasi diuji untuk melihat seberapa baik masing-masing membawa muatan RNA ke jaringan sasaran. Formulasi terpilih kemudian diberikan melalui inhalasi agar lebih terkonsentrasi di paru-paru dan dapat mencapai sel-sel saluran napas. 18

Sistem ini bersifat nonviral. LNP berfungsi membawa RNA masuk ke dalam sel, tanpa menggunakan vektor virus atau menyisipkan gen yang telah diperbaiki secara permanen. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa sup-tRNA yang dikirim melalui LNP dapat memulihkan produksi protein fungsional pada model tikus, sehingga menjadi dasar bagi pengembangan muatan tRNA khusus paru-paru dalam studi terbaru. 4

Hasil pengujian pada sel, tikus, dan organoid pasien

Kombinasi sup-tRNA termodifikasi dan LNP yang dihirup memulihkan produksi protein CFTR serta fungsi saluran yang berkaitan dengannya dalam beberapa model:

• Sel epitel bronkus manusia: terapi mendorong pelewatan kodon terminasi prematur dan memulihkan produksi CFTR utuh.
• Model tikus fibrosis kistik: pemberian melalui inhalasi mencapai paru-paru dan menghasilkan aktivitas yang bertahan hingga sekitar 40 hari pada tikus. Durasi tersebut merupakan hasil praklinis dan belum dapat dianggap berlaku pada manusia. 16
• Organoid yang berasal dari pasien: pendekatan ini memulihkan produksi CFTR utuh pada organoid yang membawa empat varian CFTR, termasuk dua varian nonsense. 18

Pengujian pada organoid juga menunjukkan batas penting dari pendekatan ini. Protein CFTR yang berhasil diproduksi masih memerlukan kombinasi korektor dan potensiator elexacaftor–tezacaftor–ivacaftor, yang dikenal sebagai Trikafta, agar dapat melipat dengan benar, mencapai lokasi yang tepat, dan menjalankan fungsi salurannya secara optimal. 13

Dengan demikian, logika terapinya kemungkinan bukan menggantikan modulator CFTR sepenuhnya, melainkan bekerja dalam dua tahap: memulihkan produksi protein terlebih dahulu, lalu membantu protein yang diselamatkan tersebut berfungsi dengan baik.

Potensi untuk penyakit genetik lain

Secara teori, sup-tRNA dapat dirancang untuk mengenali masing-masing dari tiga kodon berhenti. Hal ini menjadikan teknologinya sebagai platform berbasis kelas mutasi, bukan terapi yang hanya ditujukan untuk satu gen. Pendekatan serupa mungkin dapat diadaptasi untuk penyakit lain jika peneliti dapat memilih tRNA yang sesuai, memasukkan asam amino yang tepat, mengirimkan muatan dalam jumlah cukup ke jaringan sasaran, dan mempertahankan proses penerjemahan normal. 34

Namun, peluang tersebut tidak otomatis berarti semua penyakit dengan mutasi nonsense dapat ditangani dengan cara yang sama. Setiap protein mungkin memiliki toleransi berbeda terhadap penggantian asam amino. Protein yang berhasil dipulihkan juga bisa tetap salah melipat atau membutuhkan obat penstabil tambahan.

Pengiriman menjadi tantangan lain. Formulasi yang dirancang untuk inhalasi ke paru-paru belum tentu cocok untuk hati, otot, otak, atau ginjal. Setiap organ kemungkinan memerlukan jenis nanopartikel dan cara pemberian yang berbeda. 34

Pertanyaan keamanan masih harus dijawab

Sebelum pendekatan ini dapat diuji sebagai terapi, sejumlah pertanyaan penting perlu dijawab:

• Apakah sup-tRNA dapat menyebabkan pelewatan yang tidak diinginkan pada kodon berhenti normal?
• Apakah perubahan proses penerjemahan dapat menghasilkan protein di luar sasaran atau penggantian asam amino yang berbahaya?
• Apakah LNP aman dan tetap efektif jika diberikan melalui inhalasi berulang kali?
• Seberapa luas partikel menyebar di paru-paru, dan berapa lama aktivitasnya bertahan?
• Apakah RNA atau nanopartikel lipid memicu peradangan maupun reaksi imun lainnya?

Sejumlah laporan eksternal menyoroti peradangan yang bergantung pada dosis pada tikus serta kekhawatiran umum mengenai keamanan LNP yang dihirup. Persoalan tersebut perlu diuji secara ketat sebelum terapi ini dapat dianggap mapan secara klinis. 613

Kemajuan utama studi ini bukanlah penemuan terapi manusia yang sudah terbukti, melainkan penggabungan rekayasa kimia tRNA dengan sistem pengiriman yang diarahkan ke organ tertentu. Kombinasi tersebut membuat sup-tRNA cukup aktif dan tahan lama untuk memulihkan produksi serta fungsi CFTR dalam model praklinis dan organoid pasien.

Tantangan berikutnya adalah memastikan apakah efek ini dapat direproduksi secara aman, berulang, dan konsisten pada manusia—serta menentukan mutasi CFTR mana yang memerlukan kombinasi dengan Trikafta atau obat lain agar protein yang berhasil diselamatkan benar-benar berfungsi.