इस स्क्रीन ने दो ऐसे जीनों की पहचान की, जिन्हें निष्क्रिय (नॉकआउट) करने से सॉलिड ट्यूमर के खिलाफ CAR-T कोशिकाओं के प्रदर्शन में उल्लेखनीय वृद्धि होती है: P2RY8 और GNAS। प्रत्येक जीन एक अलग तंत्र के माध्यम से काम करता है, और दोनों एडिट्स को मिलाकर एक शक्तिशाली सहक्रियात्मक प्रभाव पैदा होता है ।

P2RY8 नॉकआउट: ट्यूमर में घुसपैठ को अनलॉक करना

ट्यूमर एक अणु उत्पन्न करते हैं जो टी कोशिकाओं पर P2RY8 रिसेप्टर को सक्रिय करता है। यह एक ब्रेक की तरह काम करता है जो टी कोशिकाओं को ट्यूमर में प्रवेश करने से शारीरिक रूप से रोकता है। P2RY8 को हटाने से यह ब्रेक समाप्त हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप बड़ी संख्या में टी कोशिकाएं सॉलिड ट्यूमर में प्रवेश कर जाती हैं । P2RY8 जीन एक G प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर (GPCR) को एनकोड करता है, जो सक्रिय होने पर Gα13 के माध्यम से संकेत भेजकर टी सेल के आवागमन को प्रतिबंधित करता है। इस मार्ग को बाधित करके, शोधकर्ताओं ने टी कोशिकाओं को ट्यूमर के अंदर उन स्तरों पर जमा होने में सक्षम बनाया जो सामान्य CAR-T कोशिकाओं के साथ असंभव था ।

GNAS नॉकआउट: कैंसर-विरोधी गतिविधि को बनाए रखना

एक बार ट्यूमर के अंदर पहुंचने के बाद, टी कोशिकाओं को एक प्रतिकूल माइक्रोएन्वायरमेंट का सामना करना पड़ता है जो दमनकारी संकेतों से भरा होता है। GNAS (जो Gαs प्रोटीन को एनकोड करता है) एक केंद्रीय सिग्नलिंग हब के रूप में कार्य करता है जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट से कई दमनकारी संकेतों को प्रोसेस करता है। GNAS को हटाने से टी कोशिकाएं उन संकेतों के प्रति काफी हद तक असंवेदनशील हो जाती हैं, जिससे वे इंटरफेरॉन-गामा (IFN-γ) का उच्च उत्पादन बनाए रख पाती हैं, जो एक प्रमुख एंटी-ट्यूमर प्रभावकारी अणु है । यह टी कोशिकाओं को उन इम्यूनोसप्रेसिव स्थितियों के प्रति प्रतिरोधी बनाता है जो आम तौर पर सॉलिड ट्यूमर के अंदर प्रतिरक्षा कार्य को पंगु बना देती हैं।

सहक्रियात्मक संयोजन: घुसपैठ और गतिविधि

P2RY8 और GNAS दोनों को एक साथ हटाने से एक सहक्रियात्मक लाभ मिलता है: टी कोशिकाएं अधिक संख्या में ट्यूमर में प्रवेश करती हैं और अंदर पहुंचने के बाद अत्यधिक सक्रिय रहती हैं। फेफड़ों के कैंसर के एक माउस मॉडल में, CAR-T कोशिकाओं की बहुत कम खुराक पर भी, अध्ययन के अंत में दो-तिहाई चूहे ट्यूमर-मुक्त थे, जबकि नियंत्रण-एडिटेड CAR-T कोशिकाएं प्राप्त करने वाले किसी भी चूहे का ट्यूमर साफ नहीं हुआ ।

सॉलिड ट्यूमर मॉडल में व्यापक प्रभाव

इन एडिट्स के लाभ केवल फेफड़ों के कैंसर तक ही सीमित नहीं हैं। केवल GNAS की कमी वाली CAR-T कोशिकाओं ने कई सॉलिड ट्यूमर मॉडलों में ट्यूमर को सिकोड़ दिया, जिनमें मेलेनोमा, फेफड़ों का कैंसर, अग्नाशय का कैंसर, गैस्ट्रोएसोफेगल एडेनोकार्सिनोमा और गर्भाशय सार्कोमा शामिल हैं । संयोजन एडिट्स ने डिम्बग्रंथि कैंसर और मेलेनोमा रोगियों से प्राप्त टी कोशिकाओं में भी काम किया, जो रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में अनुवादनीयता की पुष्टि करता है ।

ट्यूमर साफ होने के बाद छह महीने से अधिक समय तक देखे गए चूहों में कोई दीर्घकालिक दुष्प्रभाव नहीं देखा गया, जो एक अनुकूल सुरक्षा प्रोफाइल का सुझाव देता है ।

खोज के लिए एक नया मंच

P2RY8 और GNAS की पहचान उसी टीम द्वारा विकसित एक उपन्यास इन विवो CRISPR स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म द्वारा संभव हुई। यह प्लेटफॉर्म ट्यूमर-युक्त चूहों के भीतर प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं में जीनोम-स्केल लॉस-ऑफ-फंक्शन स्क्रीन की अनुमति देता है, जो पिछली सीमाओं को पार करता है जो CRISPR स्क्रीन को इन विट्रो सेटिंग्स तक सीमित करती थीं या बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता होती थी । इस प्रणाली में ट्यूमर कोशिकाओं पर CD3 scFv को ओवरएक्सप्रेस करना शामिल है ताकि ट्यूमर-इनफिल्ट्रेटिंग टी कोशिकाओं की उच्च रिकवरी प्राप्त हो सके, जो अपेक्षाकृत कम संख्या में जानवरों के साथ व्यापक विश्लेषण की अनुमति देता है ।

कैंसर इम्यूनोथेरेपी के लिए निहितार्थ

ये निष्कर्ष CAR-T सेल थेरेपी को सॉलिड ट्यूमर के खिलाफ प्रभावी बनाने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम हैं, जो अधिकांश कैंसर के लिए जिम्मेदार हैं। यह दोहरी-एडिटिंग रणनीति सॉलिड ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी के लिए दो सबसे महत्वपूर्ण बाधाओं को संबोधित करती है: खराब टी सेल घुसपैठ और इम्यूनोसप्रेसिव ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट। लंबी अवधि के माउस अध्ययनों में देखा गया अनुकूल सुरक्षा प्रोफाइल नैदानिक परीक्षण की दिशा में आगे के विकास का भी समर्थन करता है ।

इस स्क्रीन ने दो ऐसे जीनों की पहचान की, जिन्हें निष्क्रिय (नॉकआउट) करने से सॉलिड ट्यूमर के खिलाफ CAR-T कोशिकाओं के प्रदर्शन में उल्लेखनीय वृद्धि होती है: P2RY8 और GNAS। प्रत्येक जीन एक अलग तंत्र के माध्यम से काम करता है, और दोनों एडिट्स को मिलाकर एक शक्तिशाली सहक्रियात्मक प्रभाव पैदा होता है ।

P2RY8 नॉकआउट: ट्यूमर में घुसपैठ को अनलॉक करना

ट्यूमर एक अणु उत्पन्न करते हैं जो टी कोशिकाओं पर P2RY8 रिसेप्टर को सक्रिय करता है। यह एक ब्रेक की तरह काम करता है जो टी कोशिकाओं को ट्यूमर में प्रवेश करने से शारीरिक रूप से रोकता है। P2RY8 को हटाने से यह ब्रेक समाप्त हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप बड़ी संख्या में टी कोशिकाएं सॉलिड ट्यूमर में प्रवेश कर जाती हैं । P2RY8 जीन एक G प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर (GPCR) को एनकोड करता है, जो सक्रिय होने पर Gα13 के माध्यम से संकेत भेजकर टी सेल के आवागमन को प्रतिबंधित करता है। इस मार्ग को बाधित करके, शोधकर्ताओं ने टी कोशिकाओं को ट्यूमर के अंदर उन स्तरों पर जमा होने में सक्षम बनाया जो सामान्य CAR-T कोशिकाओं के साथ असंभव था ।

GNAS नॉकआउट: कैंसर-विरोधी गतिविधि को बनाए रखना

एक बार ट्यूमर के अंदर पहुंचने के बाद, टी कोशिकाओं को एक प्रतिकूल माइक्रोएन्वायरमेंट का सामना करना पड़ता है जो दमनकारी संकेतों से भरा होता है। GNAS (जो Gαs प्रोटीन को एनकोड करता है) एक केंद्रीय सिग्नलिंग हब के रूप में कार्य करता है जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट से कई दमनकारी संकेतों को प्रोसेस करता है। GNAS को हटाने से टी कोशिकाएं उन संकेतों के प्रति काफी हद तक असंवेदनशील हो जाती हैं, जिससे वे इंटरफेरॉन-गामा (IFN-γ) का उच्च उत्पादन बनाए रख पाती हैं, जो एक प्रमुख एंटी-ट्यूमर प्रभावकारी अणु है । यह टी कोशिकाओं को उन इम्यूनोसप्रेसिव स्थितियों के प्रति प्रतिरोधी बनाता है जो आम तौर पर सॉलिड ट्यूमर के अंदर प्रतिरक्षा कार्य को पंगु बना देती हैं।

सहक्रियात्मक संयोजन: घुसपैठ और गतिविधि

P2RY8 और GNAS दोनों को एक साथ हटाने से एक सहक्रियात्मक लाभ मिलता है: टी कोशिकाएं अधिक संख्या में ट्यूमर में प्रवेश करती हैं और अंदर पहुंचने के बाद अत्यधिक सक्रिय रहती हैं। फेफड़ों के कैंसर के एक माउस मॉडल में, CAR-T कोशिकाओं की बहुत कम खुराक पर भी, अध्ययन के अंत में दो-तिहाई चूहे ट्यूमर-मुक्त थे, जबकि नियंत्रण-एडिटेड CAR-T कोशिकाएं प्राप्त करने वाले किसी भी चूहे का ट्यूमर साफ नहीं हुआ ।

सॉलिड ट्यूमर मॉडल में व्यापक प्रभाव

इन एडिट्स के लाभ केवल फेफड़ों के कैंसर तक ही सीमित नहीं हैं। केवल GNAS की कमी वाली CAR-T कोशिकाओं ने कई सॉलिड ट्यूमर मॉडलों में ट्यूमर को सिकोड़ दिया, जिनमें मेलेनोमा, फेफड़ों का कैंसर, अग्नाशय का कैंसर, गैस्ट्रोएसोफेगल एडेनोकार्सिनोमा और गर्भाशय सार्कोमा शामिल हैं । संयोजन एडिट्स ने डिम्बग्रंथि कैंसर और मेलेनोमा रोगियों से प्राप्त टी कोशिकाओं में भी काम किया, जो रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में अनुवादनीयता की पुष्टि करता है ।

ट्यूमर साफ होने के बाद छह महीने से अधिक समय तक देखे गए चूहों में कोई दीर्घकालिक दुष्प्रभाव नहीं देखा गया, जो एक अनुकूल सुरक्षा प्रोफाइल का सुझाव देता है ।

खोज के लिए एक नया मंच

P2RY8 और GNAS की पहचान उसी टीम द्वारा विकसित एक उपन्यास इन विवो CRISPR स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म द्वारा संभव हुई। यह प्लेटफॉर्म ट्यूमर-युक्त चूहों के भीतर प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं में जीनोम-स्केल लॉस-ऑफ-फंक्शन स्क्रीन की अनुमति देता है, जो पिछली सीमाओं को पार करता है जो CRISPR स्क्रीन को इन विट्रो सेटिंग्स तक सीमित करती थीं या बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता होती थी । इस प्रणाली में ट्यूमर कोशिकाओं पर CD3 scFv को ओवरएक्सप्रेस करना शामिल है ताकि ट्यूमर-इनफिल्ट्रेटिंग टी कोशिकाओं की उच्च रिकवरी प्राप्त हो सके, जो अपेक्षाकृत कम संख्या में जानवरों के साथ व्यापक विश्लेषण की अनुमति देता है ।

कैंसर इम्यूनोथेरेपी के लिए निहितार्थ

ये निष्कर्ष CAR-T सेल थेरेपी को सॉलिड ट्यूमर के खिलाफ प्रभावी बनाने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम हैं, जो अधिकांश कैंसर के लिए जिम्मेदार हैं। यह दोहरी-एडिटिंग रणनीति सॉलिड ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी के लिए दो सबसे महत्वपूर्ण बाधाओं को संबोधित करती है: खराब टी सेल घुसपैठ और इम्यूनोसप्रेसिव ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट। लंबी अवधि के माउस अध्ययनों में देखा गया अनुकूल सुरक्षा प्रोफाइल नैदानिक परीक्षण की दिशा में आगे के विकास का भी समर्थन करता है ।