Onko IPTG-induktio peruuttamaton? Kirjallisuusanalyysi

Tämä tarkoittaa, että jos kohdeproteiinin ilmentäminen hidastaa oikean plasmidin omaavien solujen kasvua, solut, jotka eivät ilmennä proteiinia tai ovat menettäneet plasmidin, voivat rikastua populaatiossa – tämä on todennäköinen mekanismi heikentyneelle induktiolle myöhemmissä vaiheissa.

Proteiinitoksisuus ja IPTG:n haittavaikutukset

Rekombinanttiproteiinien toksisuus on tunnettu ongelma E. colissa, ja se on johtanut erityisesti BL21(DE3)-kannoista johdettujen C41(DE3)- ja C43(DE3)-kantojen kehittämiseen, jotka soveltuvat toksisten proteiinien tuotantoon.

Eräässä metabolisen suunnittelun mallissa havaittiin, että IPTG yhdessä toksisen substraatin kanssa aiheutti merkittävää fysiologista stressiä BL21(DE3)-kannalle. Tätä ei kuitenkaan voida yleistää väitteeksi, että IPTG itsessään olisi myrkyllistä – se pikemminkin pahentaa solun olemassa olevaa kuormitusta.

Käytännön johtopäätös laboratoriotutkijoille

Jos alkuperäiset solut ovat säilyttäneet täydellisen ja toimivan ekspressioplasmidin sekä säätelyelementit uuden viljelmän alkaessa, ja soluilla on riittävästi sukupolvia toipuakseen kasvustaan, ne periaatteessa kykenevät uudelleeninduktioon IPTG:llä.

Käytännössä tämä kuitenkin lisää epäonnistumisen todennäköisyyttä: tuotot voivat laskea ja erien välinen vaihtelu kasvaa, erityisesti kun käytetään korkean kopioluvun plasmideja, vahvoja promoottoreita, toksisia proteiineja tai pitkiä induktioaikoja korkeissa lämpötiloissa.

Keskeiset lähteet

1. Mairhofer J, et al. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during recombinant protein production. Microbial Cell Factories, 2013. – Vertailu kantojen välillä induktion jälkeisestä kasvusta ja plasmidikadosta.

2. Tripathi NK, et al. Impact of the Expression System on Recombinant Protein Production in Escherichia coli. 2021. – Katsaus transkription ja translation metaboliseen kuormaan.

3. Kopp J, et al. Optimizing recombinant protein expression via automated induction profiling in Escherichia coli. 2017. – IPTG-pitoisuuden, lämpötilan ja kuormituksen vaikutus kasvuun ja ekspressioon.

4. van Loosdrecht MCM, et al. The Impact of IPTG Induction on Plasmid Stability and Heterologous Protein Production. 2020. – Suora tutkimus IPTG:n, solujen elinkyvyn ja plasmidistabiilisuuden välisistä suhteista.

5. Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology, 1999. – Yleiskatsaus korkean kopioluvun plasmideihin ja toksisuuteen.

6. Mairhofer J, et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3). Microbial Cell Factories, 2015. – IPTG:n toksisuuden paheneminen yhdessä haitallisen substraatin kanssa.

7. Saida F. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004. – Katsaus proteiinitoksisuuteen ja soveltuviin isäntäkantoihin.

Suositus kokeelliseen varmistukseen

Jos haluat varmistaa, onko omassa kannassasi todella menetetty induktiokyky, luotettavin tapa on eristää yksittäisiä pesäkkeitä uudesta viljelmästä, varmistaa niiden antibioottiresistenssi, tehdä plasmidin restriktioanalyysi tai sekvensointi, ja verrata induktiota kontrolliin SDS-PAGE- tai Western blot -menetelmällä samalla IPTG-pitoisuudella ja samassa optisessa tiheydessä.