Muokattu tRNA ohittaa kystisen fibroosin geenivirheen

Toronton yliopiston johtama tutkijaryhmä on kehittänyt ei-virusperäisen RNA-menetelmän kystisen fibroosin muotoihin, jotka johtuvat nonsense-mutaatioista. Tällainen mutaatio lisää geenin ohjeeseen ennenaikaisen lopetussignaalin, jolloin proteiinin valmistus keskeytyy liian aikaisin.

Tutkijat eivät muokanneet CFTR-geenin DNA:ta. Sen sijaan he toimittivat soluihin muokatun suppressori-siirtäjä-RNA:n eli sup-tRNA:n, joka tunnistaa virheellisen lopetussignaalin ja auttaa ribosomia jatkamaan proteiinin valmistusta. Näin solu voi tuottaa täysimittaisen CFTR-proteiinin. 1

Tuloksia saatiin ihmisen keuhkoputkien epiteelisoluissa, hiirimalleissa ja kystistä fibroosia sairastavilta potilailta kasvatetuissa organoideissa. Kyseessä on lupaava prekliininen tutkimusasetelma, ei vielä ihmisillä osoitettu hoito.

Ennenaikainen lopetussignaali katkaisee CFTR-proteiinin

Nonsense-mutaatiossa proteiinia valmistava koneisto saa viestin lopettaa työnsä liian aikaisin. CFTR-proteiinissa tämä voi johtaa siihen, että soluissa on hyvin vähän tai ei lainkaan täysimittaista proteiinia, joka toimisi kloridikanavana.

Tämä erottaa kohderyhmän monista nykyisistä kystisen fibroosin hoidoista. CFTR-muuntajalääkkeet on suunniteltu parantamaan solun valmistaman CFTR-proteiinin laskostumista, kulkeutumista solukalvolle tai toimintaa. Ne eivät kuitenkaan voi täysin korvata tilannetta, jossa ennenaikainen lopetussignaali estää riittävän täysimittaisen proteiinin valmistumisen. Tutkimus keskittyy siksi potilasryhmään, jonka nonsense-mutaatioihin muuntajalääkkeet eivät välttämättä tehoa yksinään. 12

Nonsense-mutaatioiden arvioidaan aiheuttavan noin 11 prosenttia perinnöllisistä sairauksista. Koska samantyyppinen proteiinintuotannon virhe esiintyy monissa geeneissä, turvallista ohitusmenetelmää voitaisiin periaatteessa soveltaa myös kystisen fibroosin ulkopuolella. 2

Miten suppressori-tRNA ohittaa mutaation?

Siirtäjä-RNA eli tRNA yhdistää normaalisti lähetti-RNA:n kodoneja aminohappoihin proteiinia valmistettaessa. Tutkijat muokkasivat tRNA:ta niin, että sen antikodoni tunnistaa mutantin CFTR-lähetti-RNA:ssa olevan ennenaikaisen lopetuskodonin.

Kun sup-tRNA saapuu virheellisen lopetussignaalin kohdalle, se tuo paikalle aminohapon sen sijaan, että proteiinin valmistus päättyisi. Ribosomi voi jatkaa lähetti-RNA:n lukemista ja tuottaa täysimittaisen CFTR-proteiinin. Menetelmä kiertää väärään paikkaan joutuneen lopetusohjeen sen sijaan, että DNA-sekvenssi korjattaisiin. 14

Koska RNA ei ole tarkoitettu muuttamaan perimää pysyvästi, vaikutus on väliaikainen. Jos menetelmä etenee kliinisiin tutkimuksiin, hoito pitäisi todennäköisesti annostella toistuvasti. Sopiva annosväli riippuisi siitä, kuinka pitkään vaikutus kestää ja kuinka turvallisesti hoitoa voidaan uusia.

Luonnollinen kemiallinen muutos paransi tRNA:n toimintaa

Muokkaamattomilla suppressori-tRNA-molekyyleillä on useita haasteita. Niiden on säilyttävä riittävän pitkään, sitouduttava oikeaan aminohappoon, ohitettava lopetuskodoni tehokkaasti ja vältettävä liian voimakasta synnynnäisen immuunijärjestelmän aktivaatiota.

Tutkijat lisäsivät tRNA:han tiettyyn kohtaan kemiallisen muutoksen, jota esiintyy luonnostaan tRNA:ssa. Raportoituihin vaikutuksiin kuuluivat tehokkaampi aminoasylaatio eli tRNA:n latautuminen oikealla aminohapolla, parempi ennenaikaisen lopetuskodonin ohitus, pidempi toiminnallinen aktiivisuus ja vähäisempi synnynnäisen immuunivasteen aktivoituminen. Tutkimuksen saatavilla olevat tiedot eivät nimeä muutosta, joten sitä ei pidä kutsua esimerkiksi pseudouridiiniksi ilman erillistä näyttöä. 158

Muokkaus ratkaisi siis useita ongelmakohtia samanaikaisesti. Pelkkä lopetuskodonin ohittaminen ei riittäisi, jos tRNA latautuisi huonosti, hajoaisi nopeasti tai käynnistäisi voimakkaan tulehdusreaktion.

Hengitettävä lipidinanohiukkanen vei RNA:n keuhkoihin

Tutkijat kehittivät myös tRNA:n poikkeukselliseen rakenteeseen sopivia lipidinanohiukkasvalmisteita eli LNP-hiukkasia. He seuloivat erilaisia koostumuksia ja valitsivat keuhkoihin annettavaksi sellaisen, joka kuljetti RNA:ta tehokkaasti. Hoito annettiin hengitettävänä, jotta RNAa saataisiin mahdollisimman paljon keuhkokudokseen ja hengitysteiden soluihin. 18

Kyseessä on ei-virusperäinen kuljetusjärjestelmä. LNP-hiukkaset vievät terapeuttisen RNA:n soluihin, mutta menetelmä ei perustu virusvektoriin eikä korjattua geeniä asenneta pysyvästi perimään. Aiemmassa tutkimuksessa LNP-hiukkasiin pakattu suppressori-tRNA palautti toimivan proteiinin tuotantoa hiirimalleissa, mikä loi pohjan uudelle tRNA:lle ja keuhkoihin kohdistuvalle annostelulle. 4

Mitä solu-, hiiri- ja organoidikokeet osoittivat?

Yhdistelmähoito, jossa kemiallisesti muokattu sup-tRNA kuljetettiin hengitettävillä LNP-hiukkasilla, palautti CFTR-proteiinin tuotantoa ja siihen liittyvää kanavatoimintaa useissa kokeellisissa ympäristöissä:

• Ihmisen keuhkoputkien epiteelisolut: hoito edisti ennenaikaisen lopetuskodonin ohitusta ja täysimittaisen CFTR-proteiinin valmistumista.
• Kystisen fibroosin hiirimallit: hengitetty hoito kulkeutui keuhkoihin ja vaikutus säilyi tutkimuksessa jopa noin 40 päivää. Tämä on prekliininen havainto, eikä kestosta ihmisillä voida vielä tehdä päätelmiä. 16
• Potilaista peräisin olevat organoidit: menetelmä palautti täysimittaisen CFTR-proteiinin tuotantoa organoidissa, jossa oli neljä CFTR-muunnosta, mukaan lukien kaksi nonsense-muunnosta. 18

Organoidikoe toi esiin myös tärkeän rajoituksen. Uudelleen valmistunut CFTR-proteiini tarvitsi tässä mallissa edelleen korjaajan ja tehostajan yhdistelmää elexakaftori–tezakaftori–ivakaftori, joka tunnetaan kauppanimellä Trikafta. Lääkettä tarvittiin proteiinin optimaaliseen laskostumiseen, kuljetukseen ja kanavatoimintaan. Todennäköinen hoitologiikka olisi siis ainakin joissakin mutaatioissa: ensin palautetaan proteiinin tuotanto, sitten parannetaan tuotetun proteiinin toimintaa. Menetelmä ei välttämättä korvaisi CFTR-muuntajalääkkeitä kokonaan. 13

Voisiko sama periaate toimia muissa sairauksissa?

Suppressori-tRNA:ta voidaan periaatteessa suunnitella tunnistamaan jokainen kolmesta lopetuskodonista. Tämä tekee menetelmästä mutaatioluokkaan perustuvan alustan: samaa yleistä lähestymistapaa voitaisiin sovittaa eri sairauksiin, jos tutkijat pystyvät valitsemaan sopivan tRNA:n, lisäämään oikean aminohapon, kuljettamaan riittävän määrän RNA:ta kohdekudokseen ja säilyttämään normaalin proteiinintuotannon.

Mahdollisuus ei kuitenkaan ole automaattinen. Eri proteiinit voivat sietää erilaisia aminohappojen vaihtumisia, ja ennenaikaisen lopetuksen ohittamalla pelastettu proteiini saattaa edelleen laskostua väärin tai tarvita stabiloivaa lääkettä. Myös kuljetus on elinkohtaista. Keuhkoihin hengitettäväksi optimoitu LNP-valmiste ei välttämättä toimisi maksassa, lihaksissa, aivoissa tai munuaisissa. Näitä elimiä varten tarvittaisiin todennäköisesti erilaiset nanopartikkelit ja annostelutavat. 34

Turvallisuuskysymykset ovat vielä ratkaisematta

Ennen mahdollista ihmishoitoa on selvitettävä muun muassa:

• Voiko sup-tRNA ohittaa myös normaalit lopetuskodonit muualla elimistössä?
• Voiko muuttunut proteiinintuotanto synnyttää haitallisia sivuvaikutuksia tai vääriä aminohappovaihdoksia?
• Onko valmiste turvallinen ja tehokas toistuvina hengitettävinä annoksina?
• Kuinka laajalle se leviää keuhkoissa ja kuinka kauan vaikutus säilyy?
• Aiheuttavatko lipidinanohiukkaset tai RNA tulehdusta tai muita immuunireaktioita?

Ulkopuolisissa arvioissa on nostettu esiin hiirillä havaittu annosriippuvainen tulehdus sekä hengitettäviin LNP-hoitoihin liittyvät laajemmat hengitysturvallisuuden kysymykset. Näitä riskejä on tutkittava huolellisesti ennen kuin menetelmää voidaan pitää kliinisesti vakiintuneena. 613

Tutkimuksen keskeinen edistysaskel ei ole vielä osoitettu ihmisille tarkoitettu hoito, vaan tRNA-kemian ja elinkohtaisen kuljetuksen yhdistelmä. Sen avulla tutkijat pystyivät parantamaan lopetuskodonin ohitusta, kestävyyttä, aminohappolatausta ja siedettävyyttä sekä ohjaamaan RNA:n keuhkoihin. Seuraava kysymys on, voidaanko sama vaikutus saada ihmisillä aikaan turvallisesti, toistettavasti ja ennakoitavasti – ja tarvitsevatko eri CFTR-mutaatiot rinnalleen muuntajalääkkeen, jotta pelastettu proteiini todella toimii.