AGENTEX tester nye genetiske koder – uden at omskrive en eneste celle

AGENTEX – en forkortelse for Automated Genetic tRNA Expansion – ændrer rækkefølgen i arbejdet med at redesigne den genetiske kode. I stedet for først at omskrive en organismes genom og derefter opdage, om det nye translationssystem virker, kan forskere samle mulige systemer i laboratoriet, teste dem robotiseret og bruge de bedste designs som udgangspunkt for senere arbejde i levende celler. 6

Det rapporterede arbejde understøtter systemer, der kan bruge op til 34 aminosyrebyggesten i stedet for de 20, som indgår i den almindelige biologiske kode. 7 Det centrale gennembrud er ikke, at der pludselig findes mere end 64 codons, men at flere af de eksisterende codons kan gøres anvendelige i nye kombinationer.

Den begrænsning, AGENTEX forsøger at omgå

Den genetiske standardkode forbinder 64 mulige triplet-codons med aminosyrer samt start- og stop-signaler. Flere codons er redundante, fordi de angiver den samme aminosyre. Det skaber muligheder for at tildele nogle af dem en ny betydning.

I en levende celle er det imidlertid risikabelt at ændre betydningen af et codon. Det samme codon kan forekomme i tusindvis af vigtige gener, og en ny tildeling kan derfor føre til omfattende fejloversættelse af proteiner. En cellulær strategi kan kræve, at alle genomiske forekomster af codonet fjernes eller udskiftes, samtidig med at cellens oprindelige translationsmaskineri forhindres i at konkurrere med det konstruerede system.

AGENTEX flytter det første eksperiment ud af cellen. Forskerne kan tilsætte en tilpasset samling af translationskomponenter og undersøge, om et foreslået codon-til-aminosyre-kort producerer det ønskede protein eller peptid, før de begynder på en genomomfattende ændring. 615

Sådan fungerer de redesignede koder

Et codon fortolkes gennem samspillet mellem messenger-RNA, transfer-RNA og translationsmaskineriet. AGENTEX fokuserer på at konstruere disse molekylære forbindelser i stedet for at behandle den naturlige kode som fastlåst.

Arbejdet undersøger blandt andet konstruerede ribosomer, tRNA'er og aminoacyl-tRNA-syntetaser – enzymer, der kobler aminosyrer på tRNA'er – for at se, om de kan genkende hinanden og holdes adskilt fra det almindelige translationssystem. Platformen bruger også automatiserede metoder til at screene biblioteker af syntetiske tRNA'er for deres evne til at blive ladet med aminosyrer. 6

Det gør det muligt at tildele udvalgte codons andre aminosyrer, herunder ikke-standardaminosyrer, i en bevidst genopbygget cellefri reaktion. Tidligere rekonstruerede systemer har allerede vist, at translation kan fungere med forenklede eller ombyttede genetiske koder ved hjælp af tRNA'er transskriberet in vitro. AGENTEX udvider dette princip til en automatiseret og parallel arbejdsgang for udvikling af mange kodevarianter. 5

Det rapporterede materiale beskriver to redesignede genetiske koder, der blev testet sammen med standardkoden. Her blev op til tre codons omfordelt, og ikke-standardaminosyrer blev indbygget. 8 Fordi hvert alternativt system består af sine egne kompatible translationskomponenter, kan flere kodedesign undersøges inden for samme eksperimentelle ramme uden at påtvinge ét nyt codon-kort på et levende genom.

Hvorfor automatisering gør en forskel

En genetisk kode er ikke bare en tabel. For at en ny tildeling skal fungere, skal de relevante tRNA'er genkende de rigtige codons, de tilhørende syntetaser skal koble de korrekte aminosyrer på tRNA'erne, og ribosomet skal kunne acceptere komplekserne med tilstrækkelig præcision og effektivitet. I cellefri translation kan komponenterne tilsættes, fjernes eller udskiftes enkeltvis. 1516

AGENTEX understøtter derfor en design-byg-test-cyklus:

1. Design et muligt codon-kort og de translationskomponenter, der skal føre det ud i livet.
2. Byg kombinationer af tRNA'er, syntetaser og ribosomer i en cellefri reaktion.
3. Test aminoacylering, translation og indbygning af de udvalgte aminosyrer.
4. Sammenlign udbytte, præcision og ortogonalitet på tværs af mange kandidatsystemer.
5. Udvælg kun de mest lovende designs til mere krævende forsøg i biologiske systemer.

Den praktiske fordel er både hastighed og rækkevidde. Et mislykket design kan kasseres som en mislykket reaktion i stedet for at ende som et mislykket projekt med genmodificering af en organisme. Et vellykket design kan finjusteres, før forskerne går videre til genomredigering, opbygning af cellelinjer eller stammer og den biologiske validering, som levende celler kræver. 6

Hvad platformen endnu ikke har løst

AGENTEX demonstrerer et translationssystem in vitro. Platformen skaber ikke i sig selv en levedygtig organisme, der kan vedligeholde, kopiere og regulere en omfattende redesign af den genetiske kode.

En overførsel til levende celler vil stadig kræve flere vanskelige skridt:

• Kompatibilitet i hele genomet: Codons, der får en ny betydning, kan skulle fjernes eller udskiftes overalt i genomet, så cellens normale proteiner ikke bliver fejloversat.
• Kontrol over komponenterne: Konstruerede tRNA'er, syntetaser og muligvis ribosomer skal fungere stabilt sammen med – eller i stedet for – cellens oprindelige maskineri.
• Tilførsel af aminosyrer: Cellen skal kunne optage eller selv danne hver ikke-standardaminosyre og levere den til den rigtige translationsvej.
• Selektiv kobling: Syntetaserne skal sætte den tilsigtede aminosyre på det tilsigtede tRNA uden uønskede krydsreaktioner. 5
• Ydeevne: Det redesignede system skal opretholde tilstrækkeligt proteinudbytte, præcision, vækst og stabil nedarvning over tid.

Tidligere forsøg i levende celler viser, hvor stor udfordringen er. Et nyere pattedyrssystem rapporterede, at op til fem forskellige syntetiske aminosyrer kunne indbygges i ét protein ved at genbruge sjældne codons. 4 Det er et markant cellulært resultat, men noget andet end at demonstrere en stabil, selvreplikerende organisme, der anvender et AGENTEX-lignende system med 34 aminosyrer. Det fremlagte materiale dokumenterer ikke, at en sådan organisme er blevet bygget.

Hvad AGENTEX kan føre til

Større kemiske alfabetter til proteinudvikling

Naturlige proteiner samles af et forholdsvis lille udvalg af aminosyrebyggesten. Mere fleksible genetiske koder kan gøre det muligt at undersøge proteiner og peptidbaserede biopolymerer med kemiske grupper, sidekæder eller rygradstrukturer, som almindelig translation ikke kan levere. AGENTEX-arbejdet kobler specifikt platformen til syntese af peptidbiopolymerer og udvikling af genetiske koder efter behov. 6

Nye kandidater til lægemiddeludvikling

Ikke-standardaminosyrer kan give egenskaber, der er interessante i tidlige udviklingsprogrammer, eksempelvis ændret reaktivitet, større stabilitet eller muligheder for kontrolleret kobling til andre molekyler. AGENTEX kan gøre det lettere at screene mange molekylære designs på et tidligt tidspunkt.

Det er dog en fordel i opdagelses- og udviklingsfasen – ikke dokumentation for, at et bestemt AGENTEX-produkt allerede er et lægemiddel. En eventuel medicinsk anvendelse vil stadig kræve den sædvanlige dokumentation for effekt, sikkerhed, levering og fremstilling.

Programmerbare materialer

Ribosomal proteinsyntese giver kontrol over rækkefølgen af byggestenene. Kombineres denne præcision med et større udvalg af kemiske komponenter, kan forskere undersøge biomaterialer med nye egenskaber inden for binding, katalyse, optik, mekanik eller selvorganisering. Cellefri systemer har allerede kunnet producere aktive proteiner med redesignede kodearrangementer, hvilket giver et grundlag for denne type eksperimenter. 5

En mulig vej mod genetisk isolation

En tilstrækkeligt anderledes genetisk kode kan på længere sigt gøre det vanskeligere for konstruerede organismer at udveksle funktionel genetisk information med naturlige organismer eller at understøtte almindelige biologiske parasitter. AGENTEX viser ikke, at dette mål er nået. Det mere umiddelbare bidrag er, at forskere kan sammenligne mulige ortogonale koder, før de forsøger at installere én af dem i et levende system, der kan formere sig.

Hvordan AGENTEX adskiller sig fra tidligere metoder

Traditionel udvidelse af den genetiske kode begynder ofte med at tildele én ikke-standardaminosyre til et stopcodon eller frigøre et lille antal codons gennem omfattende genomredigering. Andre forskere har demonstreret bredere designs, blandt andet et system med 68 codons, der kunne indbygge fire forskellige ikke-kanoniske aminosyrer i det samme protein. Cellefri forskning har også skabt ombyttede eller forenklede koder ved hjælp af konstruerede eller in vitro-transskriberede tRNA'er. 35

AGENTEX' særlige bidrag er derfor arbejdsgangen lige så meget som antallet af aminosyrer: automatiseret, multiplexet prototyping af translationssystemer, før en levende celle omkodes. Platformen skaber et screeningslag mellem den teoretiske idé til en genetisk kode og en faktisk organisme. Det kan begrænse spildt arbejde, afsløre inkompatibiliteter tidligere og udvide antallet af kodearkitekturer, som forskere realistisk kan teste.

Den vigtigste forbehold er samtidig klart: AGENTEX gør alternative genetiske koder lettere at prototype. Den får ikke de biologiske og tekniske problemer ved at få sådanne koder til at fungere inde i celler til at forsvinde.