Specialdesignet tRNA kan omgå genetiske stop-signaler ved cystisk fibrose

Et forskerhold ledet af University of Toronto har udviklet en ikke-viral RNA-metode til cystisk fibrose forårsaget af nonsense-mutationer – genetiske fejl, der indsætter et for tidligt stop-signal i instruktionerne til at fremstille et protein. I stedet for at redigere CFTR-genet tilførte forskerne specialdesignede suppressor-transfer-RNA’er, eller sup-tRNA’er, som kan læse forbi det fejlplacerede signal og hjælpe cellerne med at færdiggøre produktionen af fuldlængde CFTR-protein. 1

Metoden blev undersøgt i bronkieepitelceller, musemodeller og patientafledte organoider med cystisk fibrose. Resultaterne er lovende, men der er endnu tale om en præklinisk platform – ikke en dokumenteret behandling til mennesker.

Når et for tidligt stop-signal afbryder CFTR

En nonsense-mutation får cellens proteinfabrik til at standse oversættelsen for tidligt. I CFTR-genet kan resultatet være, at cellerne producerer meget lidt eller slet intet fuldlængdeprotein, der kan fungere som kloridkanal.

Det er afgørende for forståelsen af de eksisterende lægemidler mod cystisk fibrose. CFTR-modulatorer er udviklet til at forbedre foldningen, transporten til celleoverfladen eller aktiviteten af det CFTR-protein, cellen allerede har fremstillet. De kan derfor ikke fuldt ud løse problemet, hvis et for tidligt stop-signal forhindrer dannelsen af tilstrækkeligt fuldlængdeprotein. Studiet retter sig dermed mod en undergruppe af patienter med nonsense-mutationer i CFTR, som ikke nødvendigvis får tilstrækkelig hjælp af modulatorer alene. 12

Nonsense-mutationer anslås at stå bag omkring 11 % af arvelige genetiske sygdomme. Fordi den samme type fejl kan optræde i mange forskellige gener, kan en sikker metode til at læse forbi stop-signalet i princippet tilpasses andre sygdomme end cystisk fibrose. 2

Sådan fungerer suppressor-tRNA

Transfer-RNA, eller tRNA, matcher normalt kodoner på messenger-RNA med de aminosyrer, der skal sættes sammen til et protein. Forskerne konstruerede sup-tRNA’er med antikodoner, der genkender et for tidligt stopkodon i det muterede CFTR-messenger-RNA.

Når sup-tRNA’et når frem til det fejlplacerede stop-signal, indsætter det en aminosyre i stedet for at lade oversættelsen slutte. Ribosomet kan derefter fortsætte gennem beskeden og fremstille et fuldlængde CFTR-protein. Metoden omgår altså den forkerte stop-instruktion i RNA’et i stedet for at reparere selve DNA-sekvensen. 14

Fordi RNA’et ikke er beregnet til permanent at ændre arvematerialet, er effekten midlertidig. Hvis metoden en dag kommer i klinisk brug, vil gentagne doser sandsynligvis være nødvendige. Hvor ofte, afhænger af hvor længe effekten varer, og hvor sikkert behandlingen kan gentages.

En naturlig kemisk ændring gjorde tRNA’et mere effektivt

Umodificerede sup-tRNA’er har flere udfordringer: De skal være stabile længe nok til at virke, kobles effektivt til den rigtige aminosyre, fremme læsningen af stopkodonet og samtidig undgå en for kraftig aktivering af det medfødte immunforsvar.

Forskerne indførte derfor en stedsspecifik kemisk ændring, som findes naturligt i tRNA. Ifølge resultaterne forbedrede ændringen tRNA’ets kobling til aminosyren, øgede effektiviteten ved læsning forbi det for tidlige stopkodon, forlængede den funktionelle aktivitet og dæmpede aktiveringen af det medfødte immunforsvar. Kilderne angiver ikke navnet på ændringen, så den bør ikke uden videre betegnes som eksempelvis pseudouridin. 158

Det kemiske design skulle dermed løse flere flaskehalse på én gang. Et tRNA, der kan læse forbi et stopkodon, men hurtigt nedbrydes, ikke lades korrekt med en aminosyre eller udløser en kraftig immunreaktion, vil have begrænset terapeutisk værdi.

Hvorfor behandlingen blev givet gennem luftvejene

Forskerne udviklede også lipidnanopartikler, der var tilpasset tRNA’ets særlige struktur. De screenede forskellige formuleringer for at finde den bedste levering og gav derefter de udvalgte nanopartikler som inhalation. Formålet var at koncentrere RNA’et i lungevævet og i cellerne i luftvejene. 18

Det er et ikke-viralt leveringssystem. Lipidnanopartiklerne transporterer det terapeutiske RNA ind i cellerne, men metoden er ikke afhængig af en virusvektor og indsætter ikke et korrigeret gen permanent. Tidligere arbejde havde allerede vist, at sup-tRNA leveret med lipidnanopartikler kunne genskabe produktionen af funktionelle proteiner i musemodeller. Det dannede grundlag for den nye, cargo-tilpassede og lungerettede udvikling. 4

Hvad viste forsøgene?

Kombinationen af sup-tRNA og inhalerede lipidnanopartikler genskabte CFTR-produktion og den tilknyttede kanalaktivitet i flere forsøgsmodeller:

• Menneskelige bronkieepitelceller: Behandlingen fik cellerne til at læse forbi det for tidlige stopkodon og genoptog produktionen af fuldlængde CFTR.
• Musemodeller af cystisk fibrose: Den inhalerede behandling nåede lungerne og gav en forlænget effekt, der blev rapporteret til op til omkring 40 dage i mus. Det er et præklinisk resultat, som ikke kan overføres direkte til mennesker. 16
• Patientafledte organoider: Metoden genskabte fuldlængde CFTR i et organoideksperiment med fire CFTR-varianter, herunder to nonsense-varianter. 18

Organoidforsøget viste samtidig en vigtig begrænsning. Det nyproducerede CFTR-protein havde stadig brug for kombinationen elexacaftor–tezacaftor–ivacaftor, kendt som Trikafta, for at opnå optimal foldning, transport og kanalaktivitet. Den sandsynlige behandlingsstrategi ved i hvert fald nogle mutationer er derfor: Først genskabes proteinproduktionen, derefter forbedres det reddede proteins funktion. Metoden vil altså ikke nødvendigvis erstatte CFTR-modulatorer. 13

Et muligt princip for mange andre sygdomme

Suppressor-tRNA’er kan i princippet designes til at genkende hver af de tre stopkodoner. Det gør teknologien til en mulig mutationsklasse-platform: Den samme overordnede strategi kan måske tilpasses forskellige sygdomme, hvis forskerne kan vælge det rigtige tRNA, indsætte en passende aminosyre, levere tilstrækkeligt RNA til det relevante væv og samtidig bevare en normal proteinsyntese.

Potentialet er bredt, men det kommer ikke automatisk. Forskellige proteiner kan tåle forskellige aminosyresubstitutioner, og et protein, der reddes fra et for tidligt stop, kan stadig folde forkert eller have brug for et stabiliserende lægemiddel. Leveringen er også afhængig af organet. En formulering, der er optimeret til inhalation i lungerne, vil ikke nødvendigvis fungere i lever, muskler, hjerne eller nyrer. De organer kan kræve andre nanopartikler og andre administrationsformer. 34

Sikkerhedsspørgsmål skal afklares

Før metoden kan udvikles til en behandling, skal forskerne blandt andet undersøge:

• Kan sup-tRNA’et få cellerne til utilsigtet at læse forbi normale stopkodoner?
• Kan den ændrede proteinsyntese føre til skadelige proteiner eller forkerte aminosyresubstitutioner?
• Er formuleringen sikker og effektiv ved gentagne inhalationer?
• Hvor bredt fordeler den sig i lungerne, og hvor længe forbliver den aktiv?
• Kan lipidnanopartiklerne eller RNA’et udløse betændelse eller andre immunreaktioner?

Ekstern omtale har peget på dosisafhængig inflammation i mus samt bredere spørgsmål om sikkerheden ved inhalerede lipidnanopartikler. Det gør sikkerheden for luftvejene til et centralt punkt, der skal undersøges grundigt, før metoden kan betragtes som klinisk etableret. 613

Studiens vigtigste fremskridt er kombinationen af tRNA-kemi og målrettet levering til et bestemt organ. Ved at forbedre læsningen forbi stopkodonet, holdbarheden, aminosyreladningen og tolerabiliteten – og samtidig sende cargoen til lungerne – genskabte forskerne meningsfuld CFTR-produktion og -funktion i prækliniske modeller og patientafledte organoider.

Det næste afgørende spørgsmål er, om effekten kan gentages sikkert og forudsigeligt hos mennesker, og om forskellige CFTR-mutationer vil kræve kombinationsbehandling for at få det genskabte protein til at fungere.