Nestabilita/ztráta plazmidů po indukci je reálný jev, který se však liší podle hostitele, vektoru a kultivačních podmínek.
V porovnání průmyslových kmenů E. coli přestal HMS174(DE3) po indukci růst, ale udržel si expresní vektor; BL21(DE3) a RV308(DE3) naopak ztratily plazmid a dále rostly.
Pokud tedy exprese cílového proteinu způsobuje, že buňky se správným plazmidem rostou pomaleji, buňky s nižší expresí, bez plazmidu nebo s výhodnou mutací se mohou v kultuře relativně hromadit. To je věrohodný mechanismus pro „horší indukovatelnost“ v pozdějších fázích, nikoli nevyhnutelný a dědičný účinek IPTG.
Toxicita proteinu je důležitý rizikový faktor.
Toxicita rekombinantních proteinů je u E. coli známý problém, který vedl k vytvoření kmenů C41(DE3) a C43(DE3) odvozených od BL21, vhodnějších pro expresi toxických proteinů.
V konkrétním modelu metabolického inženýrství u BL21(DE3) způsobila kombinace IPTG a toxického substrátu výrazný fyziologický stres. Toto nelze zobecnit na „IPTG je vždy toxický“, ale ukazuje to, že indukční podmínky mohou prohloubit již existující zátěž buněk.
Nejpřesnější závěr k původní otázce tedy je:
Pokud si mateřské buňky po noční indukci zachovají intaktní a funkční expresní plazmid i regulační prvky a následná nová kultura má dostatek generací k obnovení zdravého růstu, mohou být v pozdější fázi hlavní kultury v zásadě znovu indukovány IPTG.
Tento postup však zvyšuje pravděpodobnost selhání exprese, nižšího výtěžku a variability šarží, zejména při použití plazmidů s vysokým kopiovým číslem, silného promotoru, toxického proteinu, dlouhé indukce při 37 °C nebo vysoké koncentrace IPTG.
Mairhofer J, et al. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during recombinant protein production. Microbial Cell Factories. 2013. — Srovnání růstu a ztráty plazmidů po indukci u několika hostitelů.
Tripathi NK, et al. Impact of the Expression System on Recombinant Protein Production in Escherichia coli. 2021. — Diskuse metabolického zatížení transkripcí/translací cizích genů a volby expresního systému.
Kopp J, et al. Optimizing recombinant protein expression via automated induction profiling in Escherichia coli. 2017. — Ukazuje význam koncentrace IPTG, teploty a metabolického zatížení pro růst a expresi.
van Loosdrecht MCM, et al. The Impact of IPTG Induction on Plasmid Stability and Heterologous Protein Production. 2020. — Přímé zkoumání vztahu indukce IPTG, viability buněk a stability plazmidů.
Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 1999; a další přehledy. — Vysvětluje, že plazmidy s vysokým kopiovým číslem, toxické cizí geny a husté kultury zvyšují riziko ztráty plazmidů.
Mairhofer J, et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3). Microbial Cell Factories. 2015. — Experimentální příklad, kdy IPTG zesiluje stávající stres buněk v konkrétním systému.
Saida F. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 2004. — Přehled toxicity rekombinantních proteinů a vhodných hostitelských kmenů.
Experimentálně je nejpřesvědčivější způsob, jak zjistit, zda vaše konkrétní šarže skutečně „ztratila schopnost indukce“, nikoli teoretická úvaha, ale izolace jednotlivých kolonií z nové kultury: ověřit rezistenci, provést restrikční analýzu/sekvenování plazmidu a při stejné OD a stejných podmínkách IPTG s neindukovanou kontrolou provést SDS-PAGE nebo Western blot.
Nestabilita/ztráta plazmidů po indukci je reálný jev, který se však liší podle hostitele, vektoru a kultivačních podmínek.
V porovnání průmyslových kmenů E. coli přestal HMS174(DE3) po indukci růst, ale udržel si expresní vektor; BL21(DE3) a RV308(DE3) naopak ztratily plazmid a dále rostly.
Pokud tedy exprese cílového proteinu způsobuje, že buňky se správným plazmidem rostou pomaleji, buňky s nižší expresí, bez plazmidu nebo s výhodnou mutací se mohou v kultuře relativně hromadit. To je věrohodný mechanismus pro „horší indukovatelnost“ v pozdějších fázích, nikoli nevyhnutelný a dědičný účinek IPTG.
Toxicita proteinu je důležitý rizikový faktor.
Toxicita rekombinantních proteinů je u E. coli známý problém, který vedl k vytvoření kmenů C41(DE3) a C43(DE3) odvozených od BL21, vhodnějších pro expresi toxických proteinů.
V konkrétním modelu metabolického inženýrství u BL21(DE3) způsobila kombinace IPTG a toxického substrátu výrazný fyziologický stres. Toto nelze zobecnit na „IPTG je vždy toxický“, ale ukazuje to, že indukční podmínky mohou prohloubit již existující zátěž buněk.
Nejpřesnější závěr k původní otázce tedy je:
Pokud si mateřské buňky po noční indukci zachovají intaktní a funkční expresní plazmid i regulační prvky a následná nová kultura má dostatek generací k obnovení zdravého růstu, mohou být v pozdější fázi hlavní kultury v zásadě znovu indukovány IPTG.
Tento postup však zvyšuje pravděpodobnost selhání exprese, nižšího výtěžku a variability šarží, zejména při použití plazmidů s vysokým kopiovým číslem, silného promotoru, toxického proteinu, dlouhé indukce při 37 °C nebo vysoké koncentrace IPTG.
Mairhofer J, et al. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during recombinant protein production. Microbial Cell Factories. 2013. — Srovnání růstu a ztráty plazmidů po indukci u několika hostitelů.
Tripathi NK, et al. Impact of the Expression System on Recombinant Protein Production in Escherichia coli. 2021. — Diskuse metabolického zatížení transkripcí/translací cizích genů a volby expresního systému.
Kopp J, et al. Optimizing recombinant protein expression via automated induction profiling in Escherichia coli. 2017. — Ukazuje význam koncentrace IPTG, teploty a metabolického zatížení pro růst a expresi.
van Loosdrecht MCM, et al. The Impact of IPTG Induction on Plasmid Stability and Heterologous Protein Production. 2020. — Přímé zkoumání vztahu indukce IPTG, viability buněk a stability plazmidů.
Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 1999; a další přehledy. — Vysvětluje, že plazmidy s vysokým kopiovým číslem, toxické cizí geny a husté kultury zvyšují riziko ztráty plazmidů.
Mairhofer J, et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3). Microbial Cell Factories. 2015. — Experimentální příklad, kdy IPTG zesiluje stávající stres buněk v konkrétním systému.
Saida F. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 2004. — Přehled toxicity rekombinantních proteinů a vhodných hostitelských kmenů.
Experimentálně je nejpřesvědčivější způsob, jak zjistit, zda vaše konkrétní šarže skutečně „ztratila schopnost indukce“, nikoli teoretická úvaha, ale izolace jednotlivých kolonií z nové kultury: ověřit rezistenci, provést restrikční analýzu/sekvenování plazmidu a při stejné OD a stejných podmínkách IPTG s neindukovanou kontrolou provést SDS-PAGE nebo Western blot.