AGENTEX mění pravidla genetického kódu – bez přepisování jediné buňky

AGENTEX, zkratka pro Automated Genetic tRNA Expansion, mění pořadí kroků při tvorbě alternativního genetického kódu. Místo toho, aby vědci nejprve přepsali genom organismu a teprve potom zjišťovali, zda nový překladový systém funguje, mohou kandidátní systémy sestavit ve zkumavce, roboticky je otestovat a k buněčným experimentům posunout jen nejslibnější návrhy. 6

Podle popsaných výsledků dokážou přepracované systémy pracovat až s 34 aminokyselinovými stavebními bloky namísto 20, které používá standardní biologický kód. 7 Nejde přitom o vytvoření více než 64 kodonů. Pokrok spočívá v tom, že větší část existujících kodonů lze využít v nových přiřazeních.

Proč je změna genetického kódu v buňce tak obtížná

Standardní genetický kód přiřazuje 64 možných trojic nukleotidů – kodonů – 20 aminokyselinám a signálům START nebo STOP. Několik kodonů je redundantních, protože označují stejnou aminokyselinu. Právě tato nadbytečnost vytváří prostor pro jejich přeřazení.

V živé buňce je však změna významu jediného kodonu riskantní. Stejný kodon se může vyskytovat v celé řadě nezbytných genů. Pokud začne označovat jinou aminokyselinu, může dojít k rozsáhlému chybnému překladu proteinů. Buněčný přístup proto často vyžaduje nahradit nebo odstranit všechny výskyty daného kodonu v genomu a zároveň zabránit přirozenému překladovému aparátu, aby konkuroval novému systému.

AGENTEX přesouvá první test mimo buňku. Výzkumníci mohou dodat vlastní sadu překladových součástí a ověřit, zda navržená mapa kodonů a aminokyselin vytvoří zamýšlený protein nebo peptid, ještě než se pustí do rozsáhlých úprav genomu. 615

Jak přepracované kódy fungují

Kodonu není přiřazena aminokyselina izolovaně. Jeho význam vzniká při spolupráci messengerové RNA, transferové RNA neboli tRNA a celého překladového aparátu. AGENTEX se zaměřuje právě na přeprogramování těchto molekulárních vazeb, nikoli na předpoklad, že přirozený kód je neměnný.

Popsaná práce zkoumala upravené ribozomy, tRNA a aminoacyl-tRNA syntetázy – enzymy, které připojují aminokyseliny k tRNA – a ověřovala, zda se navzájem správně rozpoznají a zda zůstávají oddělené od standardního překladového systému. Součástí platformy byly také automatizované metody pro testování knihoven syntetických tRNA a jejich „nabíjení“ správnými aminokyselinami. 6

To umožňuje přiřadit vybrané kodony jiným aminokyselinám, včetně aminokyselin, které se v běžném biologickém kódu nepoužívají, a to v záměrně sestavené bezbuněčné reakci. Už dřívější rekonstituované systémy ukázaly, že překlad může fungovat i s přepracovanými kódovými tabulkami; AGENTEX tento princip rozšiřuje o paralelní a automatizované prototypování. 5

Dodané podklady popisují dva přepracované genetické kódy testované vedle standardního kódu. Tyto systémy zahrnovaly nestandardní aminokyseliny a přeřazení až tří kodonů. 8 Protože každý návrh využívá vlastní kompatibilní překladové součásti, lze různé varianty porovnávat v jednom experimentálním rámci, aniž by bylo nutné vnucovat jediný nový význam kodonů živému genomu.

Co do experimentu přináší robotizace

Genetický kód není jen tabulka. Aby nové přiřazení fungovalo, příslušné tRNA musí rozpoznat správné kodony, odpovídající syntetázy je musí nabít správnými aminokyselinami a ribozom musí výsledné komplexy přijmout s dostatečnou přesností i účinností. Bezbuněčné překladové systémy umožňují jednotlivé součásti samostatně přidávat, vynechávat nebo vyměňovat. 1516

AGENTEX této kontroly využívá v cyklu „navrhni–sestav–otestuj“:

1. Navrhnout kandidátní tabulku kodonů a součásti potřebné k jejímu uskutečnění.
2. Sestavit kombinace tRNA, syntetáz a ribozomů v bezbuněčné reakci.
3. Otestovat nabíjení tRNA, překlad a zabudování vybraných aminokyselin.
4. Porovnat výtěžek, přesnost a ortogonalitu jednotlivých systémů.
5. Posunout dál jen návrhy, které obstojí v náročnějších biologických zkouškách.

Praktický přínos je zřejmý: rychlost a šíře testování. Neúspěšný návrh lze vyřadit jako nefunkční reakci, místo aby se stal neúspěšným projektem úpravy celého organismu. Funkční variantu lze dále vylepšit ještě před editací genomu, konstrukcí kmene a ověřováním v živých buňkách. 6

Co AGENTEX zatím nevyřešil

AGENTEX ukazuje překladový systém in vitro. Sám o sobě nevytváří životaschopný organismus, který by dokázal výrazně přepracovaný genetický kód udržovat, replikovat, regulovat a přesně používat.

Přenos do živé buňky by stále vyžadoval několik obtížných kroků:

• Kompatibilitu s genomem: Přeřazené kodony by možná bylo nutné z genomu odstranit nebo nahradit, aby nedocházelo k chybnému překladu přirozených proteinů.
• Kontrolu překladového aparátu: Upravené tRNA, syntetázy a případně ribozomy by musely spolehlivě fungovat vedle přirozeného aparátu, nebo jej nahradit.
• Dostupnost aminokyselin: Buňka by musela každou nestandardní aminokyselinu získávat či vyrábět a dopravit ji ke správné překladové dráze.
• Selektivní nabíjení tRNA: Syntetázy by musely připojovat zamýšlenou aminokyselinu ke správné tRNA a současně se vyhnout nežádoucím reakcím. 5
• Dostatečný výkon: Nový systém by musel dlouhodobě zachovat přijatelnou výtěžnost proteinů, přesnost, růst buněk i dědičnost.

Rozsah této výzvy ukazují i dřívější buněčné výsledky. Jeden nedávný systém v savčích buňkách umožnil zabudovat do jediného proteinu až pět různých syntetických aminokyselin díky přeřazení vzácných kodonů. 4 Jde o významný buněčný výsledek, ale o jiný typ úspěchu než stabilní, samostatně se replikující organismus využívající celý návrh ve stylu AGENTEX se 34 aminokyselinami. Dodané podklady nepotvrzují, že takový organismus již vznikl.

K čemu by technologie mohla vést

Větší chemická abeceda pro tvorbu proteinů

Přirozené proteiny se skládají z poměrně omezené sady aminokyselin. Flexibilnější kód by umožnil zkoumat proteiny a peptidové biopolymery s chemickými skupinami, postranními řetězci nebo částmi páteře, které běžný překlad nedokáže nabídnout. Zpráva o AGENTEX platformu výslovně spojuje se syntézou peptidových biopolymerů a prototypováním genetických kódů podle aktuální potřeby. 6

Nové kandidáty pro vývoj léčiv

Nestandardní aminokyseliny mohou přinést vlastnosti užitečné při hledání léčiv – například odlišnou reaktivitu, vyšší stabilitu nebo možnosti řízeného navázání dalších molekul. AGENTEX by mohl usnadnit rané testování většího počtu molekulárních návrhů. Neznamená to však, že vznikl konkrétní lék; každý budoucí terapeutický produkt by stále musel projít ověřením účinnosti, bezpečnosti, dopravy do organismu i výroby.

Programovatelné materiály

Ribozomální syntéza poskytuje přesnou kontrolu nad pořadím stavebních jednotek. Pokud se tato kontrola spojí s širší chemickou nabídkou, mohou vzniknout biomateriály s novými vazebnými, katalytickými, optickými, mechanickými nebo samouspořádávacími vlastnostmi. Bezbuněčné systémy už dokázaly vyrábět aktivní proteiny s využitím přepracovaných kódových uspořádání, což pro tento směr vytváří základ. 5

Možná cesta ke genetické izolaci

Dostatečně odlišný genetický kód by v budoucnu mohl ztížit výměnu funkční genetické informace mezi upravenými a přirozenými organismy nebo omezit schopnost běžných biologických parazitů takový organismus využít. AGENTEX tento výsledek neprokazuje. Jeho bezprostřednější přínos spočívá v možnosti porovnat kandidátní ortogonální kódy ještě před mnohem obtížnějším pokusem instalovat jeden z nich do živého, rozmnožujícího se systému.

Jak se AGENTEX liší od dřívějších přístupů

Tradiční rozšiřování genetického kódu často začínalo přiřazením jedné nestandardní aminokyseliny ke kodonu STOP nebo uvolněním malého počtu kodonů pomocí rozsáhlých úprav genomu. Jiné práce popsaly širší návrhy, například 68kodonový systém schopný zabudovat do jediného proteinu čtyři různé nekánonické aminokyseliny. Bezbuněčné výzkumy rovněž vytvořily prohozené či zjednodušené kódy s použitím upravených nebo laboratorně přepsaných tRNA. 35

Specifický přínos AGENTEX proto nespočívá jen v počtu aminokyselin, ale i v celém pracovním postupu: v automatizovaném a paralelním prototypování překladových systémů před buněčným přeprogramováním. Platforma vytváří mezikrok mezi teoretickým návrhem genetického kódu a živým organismem. Může odhalit nekompatibility dříve, omezit zbytečně vynaložené úsilí a rozšířit počet architektur, které lze prakticky otestovat.

Hlavní výhrada je stejně důležitá jako samotný technologický posun: AGENTEX usnadňuje prototypování alternativních genetických kódů, ale neodstraňuje biologické a technické problémy spojené s jejich fungováním uvnitř živých buněk.