Upravená tRNA může obejít genetickou „stopku“ u cystické fibrózy

Výzkumný tým vedený University of Toronto představil nevirální RNA strategii pro cystickou fibrózu způsobenou takzvanými nonsense mutacemi. Jde o genetické chyby, které do návodu pro tvorbu bílkoviny vloží předčasný signál „stop“. Buňka pak výrobu proteinu ukončí příliš brzy.

Místo úpravy DNA vědci dodali do buněk upravenou supresorovou transferovou RNA neboli sup-tRNA. Ta byla navržena tak, aby chybný stop signál přečetla jako běžnou součást instrukce a umožnila ribozomu pokračovat v tvorbě plnohodnotného proteinu CFTR. Výsledky získané v buňkách průduškového epitelu, na myších modelech a v organoidech odvozených od pacientů jsou slibné, stále však jde pouze o preklinický výzkum. 1

Když předčasná „stopka“ zkrátí CFTR

Při nonsense mutaci se buněčný aparát pro tvorbu proteinů zastaví předčasně. U genu CFTR to může znamenat, že buňky vytvoří jen zkrácený protein, případně nevytvoří dostatek plnohodnotného proteinu schopného fungovat jako chloridový kanál.

To je důležité i z hlediska současné léčby cystické fibrózy. Modulátory CFTR zlepšují skládání, transport nebo aktivitu proteinu, který buňka dokázala vyrobit. Nemohou však plně nahradit jeho tvorbu v případě, že předčasný stop signál zabrání vzniku dostatečného množství kompletního CFTR. Nová strategie proto cílí na skupinu pacientů s nonsense mutacemi, u nichž samotné modulátory nemusí být dostatečně účinné. 12

Nonsense mutace se podle odhadů podílejí přibližně na 11 % dědičných genetických onemocnění. Protože podobná chyba v překladu genetické informace se objevuje v mnoha různých genech, mohla by se strategie teoreticky uplatnit i mimo cystickou fibrózu. 2

Jak supresorová tRNA chybu obejde

Transferová RNA za běžných okolností během tvorby proteinu přiřazuje jednotlivým kodonům messengerové RNA odpovídající aminokyseliny. Vědci její část, takzvaný antikodon, upravili tak, aby rozpoznala předčasný terminační kodon v chybné messengerové RNA CFTR.

Když upravená tRNA dorazí k této chybné „stopce“, vloží místo ukončení další aminokyselinu. Ribozom pak může pokračovat ve čtení instrukce a vytvořit celý protein CFTR. Nejde tedy o opravu samotné DNA, ale o dočasné obejití chybného pokynu během překladu genetické informace. 14

Protože RNA nemá trvale měnit genom, je tento přístup dočasný. Pokud by se někdy dostal do klinického použití, pravděpodobně by vyžadoval opakované dávkování. Jak často, by záleželo na délce účinku a bezpečnosti opakované aplikace.

Chemická úprava prodloužila účinek tRNA

Neupravené supresorové tRNA mají několik slabin: musí v těle vydržet dostatečně dlouho, správně se „nabít“ příslušnou aminokyselinou, účinně podporovat překlenutí předčasného stop kodonu a zároveň nevyvolat příliš silnou reakci vrozené imunity.

Výzkumníci proto zavedli přesně umístěnou chemickou úpravu, která se přirozeně vyskytuje v tRNA. Podle studie tato změna zlepšila navázání správné aminokyseliny, zvýšila účinnost čtení přes předčasný stop kodon, prodloužila funkční aktivitu tRNA a omezila aktivaci vrozeného imunitního systému. Dostupné podklady neuvádějí název konkrétní úpravy, a nelze ji proto bez opory označovat například za pseudouridin. 158

Úprava tak řešila několik problémů najednou. tRNA, která sice překoná stop kodon, ale rychle se rozpadá, špatně se nabíjí nebo vyvolává výrazný zánět, by měla omezený léčebný potenciál.

Proč vědci zvolili inhalaci

Tým současně vyvinul lipidové nanočástice přizpůsobené neobvykle strukturovanému nákladu tRNA. Různé formulace nejprve porovnal z hlediska účinnosti dopravy a vybranou variantu následně podával inhalací. Cílem bylo soustředit RNA v plicní tkáni a v buňkách dýchacích cest. 18

Jde o nevirální systém. Lipidové nanočástice dopraví terapeutickou RNA do buněk, ale nespoléhají na virový vektor ani na trvalé vložení opraveného genu. Starší výzkum už ukázal, že supresorové tRNA dopravené pomocí LNP mohou u myší obnovit tvorbu funkčních proteinů s nonsense mutacemi. Nová studie na tento základ navázala přesnějším návrhem nákladu a zaměřením na plíce. 4

Co ukázaly buněčné, zvířecí a organoidové modely

Kombinace sup-tRNA a inhalačních LNP obnovila tvorbu CFTR a související funkci chloridového kanálu v několika experimentálních systémech:

• Buňky lidského průduškového epitelu: léčba podpořila překlenutí předčasného terminačního kodonu a obnovila tvorbu plnohodnotného CFTR.
• Myší modely cystické fibrózy: inhalovaná léčba se dostala do plic a její účinek přetrvával až přibližně 40 dní. Tuto dobu však nelze automaticky přenášet na člověka. 16
• Organoidy odvozené od pacientů: přístup obnovil plnohodnotný CFTR v organoidu nesoucím čtyři varianty genu CFTR, včetně dvou nonsense variant. 18

Organoidový experiment zároveň ukázal důležité omezení. Nově vytvořený CFTR v tomto modelu stále potřeboval kombinaci korektoru a potenciátoru elexakaftor–tezakaftor–ivakaftor, známou jako Trikafta, aby se správně poskládal, dostal na buněčnou membránu a optimálně fungoval. Pravděpodobným léčebným principem tedy u některých mutací nebude nahrazení modulátorů, ale jejich kombinace: nejprve obnovit tvorbu proteinu a poté zlepšit jeho vlastnosti. 13

Potenciál pro další genetická onemocnění

Supresorové tRNA lze teoreticky navrhnout tak, aby rozpoznaly kterýkoli ze tří terminačních kodonů. To z této technologie dělá platformu zaměřenou na určitý typ mutace, nikoli pouze na jeden konkrétní gen.

Širší využití však není automatické. Různé proteiny mohou rozdílně snášet aminokyselinu vloženou na místo předčasného stop signálu. Zachráněný protein se navíc může stále špatně skládat nebo může vyžadovat stabilizační léčivo. Rozhodující bude také doručení do správného orgánu. Nanočástice optimalizované pro inhalaci do plic nemusí fungovat v játrech, svalech, mozku nebo ledvinách; pro každou tkáň může být potřeba jiná formulace i způsob podání. 34

Bezpečnost zůstává hlavní překážkou

Před případným zahájením klinického vývoje bude nutné zodpovědět několik otázek:

• Nemůže supresorová tRNA způsobit nežádoucí čtení přes běžné stop kodony?
• Nemůže pozměněný překlad vytvářet škodlivé proteiny nebo nevhodné aminokyselinové záměny?
• Je formulace bezpečná a účinná při opakovaných inhalovaných dávkách?
• Jak rovnoměrně se rozšíří v plicích a jak dlouho zůstane aktivní?
• Mohou RNA nebo lipidové nanočástice vyvolat zánět či jinou imunitní reakci?

Externí komentáře upozornily na zánět závislý na dávce u myší a na obecnější otázky týkající se bezpečnosti inhalovaných LNP. Tyto problémy bude třeba pečlivě prověřit, než bude možné o přístupu hovořit jako o klinicky zavedené léčbě. 613

Hlavní přínos studie spočívá v propojení chemického vylepšení tRNA s cíleným doručením do plic. Díky tomu se podařilo zlepšit čtení přes předčasný stop kodon, trvanlivost, navázání aminokyseliny i snášenlivost a současně obnovit významnou část tvorby a funkce CFTR v buněčných, zvířecích a pacientských modelech. Další krok bude mnohem náročnější: zjistit, zda lze stejný účinek bezpečně, opakovaně a předvídatelně reprodukovat u lidí a zda budou u různých mutací nutné kombinace s modulátory CFTR.